Оптимізація процесів культивування у виробництві пробіотичних препаратів на основі лактобацил

Коефіцієнт заповнення в усіх варіантах відповідав 0, 65-0, 75V/V.

Культивування молочнокислих бактерій для визначення особливостей росту, біосинтетичних властивостей і антагоністичної активності проводили при 390С на рідких поживних середовищах MRS (середовище Де Мана і співробітників, 1960), MRSt, MRSj, MRSjt, а також на середовищах, складених з ферментативних гідролізатів промислової сировини – казеїну (ГОСТ 17626-81), соєвого борошна (ГОСТ 3898-56), технічного цукру, гідролізованого кислотним методом, ряду солей і дріжджового автолізату картопляного крахмалю, гідролізованого ферментами.

Використововали концентрат “Йодіс”, з вмістом йоду 17, 5 мг/дм3 для утворення концентрації йоду в живильному середовищі на рівні рекомендованих 0, 1-0, 3 мг/дм3 (спільний проект МПК “Ярк – Київ” і НВК “Йодіс”, 2002 р.).

В якості гідролізуючих ферментів використовували лужну протеіназу Г20x і протакрин Г20x з активністю 100000 од/г, L-амілазу Г20Х та глюковоморим Г20Х (ДП “ЕНЗИМ”, Україна).

Для дослідження впливу дози посівного материалу на розвиток L. delbrueckii supsp. bulgaricus 51 на ферментаційних середовищах використовували посівний матеріал 1, 3, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30 и 35% від об’єму середовища: вивчали вплив початкових значень рН на зростання і наступну лізуємість клітин L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 лізоцимом при використанні поживних середовищ з початковим значенням рН 5, 5; 6, 0; 6, 5; 7, 0; 7, 5 и 8, 0. Вплив температури перевіряли при 32, 37, 40, 45 и 50°С.

Вплив інтенсивності аерації на розвиток і рівень лізису клітин досліджували при вирощуванні культури в колбах Ерленмейєра об’ємом 500 мл при 220 об/хв. з різним об’ємом середовища. Використовували сульфітний метод (Low, 1996).

У якості джерел вуглецю використовували глюкозу, сахарозу, лактозу, мальтозу, галактозу, маннозу, гідролізати сахарози та картопляного крохмалю.

У якості різних джерел органічного азоту вводили в середовище пептон, дріжджовий і кукурудзяний екстракти, сухе молоко, цистін, цистеін, гідролізати соєвого борошна і казеїну з молока.

Джерелами неорганічного азоту в кількості 0, 01% (по азоту) виступали нітрати калію, натрію, магнію, аммонія, хлориду і сульфату аммонія, а також натрій-аммоній фосфату.

Для вивчення впливу мікроелементів використовували: сульфати марганцю, кобальту, міді, цинку, заліза 2-х і 3-х валентного, нікель – у вигляді хлориду, молібден – у вигляді молібдату аммонія, які додавали в кількості 0, 001%, за виключенням марганцю, який вносили в кількості 0, 01%. Вплив іонної сили вивчали додаванням в середовище натрію хлористого до концентрації (%) : 0, 5; 1, 0; 1, 5 і 2, 0.

Мікробіологічну чистоту і морфологічну характеристику культури контролювали мікроскопічними методами та висівами розведень на контрольного середовища.

Життєздатність клітин лактобактерій після ліофілізації визначали шляхом підрахунку колоній після висіву суспензії на чашки з щільним поживним середовищем. У виробничих умовах життєздатність клітин ліофілізованої біомаси досліджували методом, який заснований на здатності молочнокислих гомоферментативних бактерій окислювати глюкозу в молочну кислоту, що призводить до зниження рН суспензії мікроорганізмів (Кігель, 2003).

Визначення амінокислотного складу ферментативних середовищ, культуральних рідин і клітинних лізатів проводили методом рідинної іонообмінної колоночної хроматографії (Low, 1996).

Визначення антагоністичної активності культур лактобaцил проводили на щільному поживному середовищі МRS за допомогою лунок, які робили свердлом (d=5 мм). Оцінку антагоністичної активності лактобацил визначали за затримкою росту тест-культур і виражали в мм.

Антагонізм лактобактерій визначали також при їх спільному вирощуванні з тест-культурами на бульоні МРS методом дворазових серійних розведень.

З метою вибору стандартних умов проведення ферментативного гідролізу клітин L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 лізоцимом і відпрацювання методики визначення ступеню літичної чутливості клітин, досліджували вплив різних концентрацій лізоциму, температури і тривалості процесу гідролізу.

Були також підібрані навантаження літичного ферментного комплексу на 1 мл суспензії клітин різних штамів лактобактерій.

Вихідна концентрація розчину ферментного препарату з Act. recifensis var. lyticus 2435 (“Рефензим”) з активністю 140000 ЛЕ/г складала 60 мг/мл.

Протипухлинні властивості досліджували згідно вимог ФК України на нелінійних мишах лінії ДВА/2 обох статей розводки віварію ІЭПОР ім. Р. Е. Кавецького НАН України (Low, 1996).

Імунологічна активність визначалась за індексом стимуляції фагоцитозу (Reddy, 1993).

Наведені результати є середнім значенням дослідів, здійснених не менше ніж в трьох повторностях.

Статистичні розрахунки. Статистичну обробку проводили за стандартною методикою (Лакин, 1980). Вірогідність різниці оцінювали за допомогою критеріїв Стьюдента або Фішера. Різниця визнавалася вірогідною при P≥0, 95.

Результати досліджень та їх обговорення

Визначення впливу умов культивування. Узагальнюючи результати досліджень, направлених на з’ясування оптимальних технологічних параметрів культивування штаму L. delbrueckii subsp. bulgaricus 51 і одержання сприйнятливої до дії лізоциму біомаси встановлено, що процес культивування у виробничих умовах доцільно проводити при 39±10С, при вихідному значенні рН середовища 6, 5÷7, вносячи молодий посівний матеріал в кількості не менше 10% від об’єму ферментаційного поживного середовища. Культивування слід проводити без примусової аерації, але при перемішуванні в режимі 40 об/хв, коефіцієнті заповнення ферментатора 0, 75% і використанні багатоярусної мішалки (рис. 1-3).

Визначення впливу окремих компонентів складу поживних середовищ.

Оскільки основним об’єктом даного дослідження була виробнича культура, яка введена в технологічні процеси більше 30 років тому з метою одержання речовин, які мають протипухлинну активність, і яка знаходилась довгий період в анабіотичному стані лабораторного зберігання, задача, що постала перед нами,