Ізоферментний склад пероксидази озимих зернових за умов низькотемпературного стресу

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

 

КАПУСТЯН АНДРІЙ ВАСИЛЬОВИЧ

 

УДК 581. 522. 4: 577. 150. 36

 

 

03. 00. 12. – фізіологія рослин

 

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

 

Київ – 2002

 

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана на кафедри фізіології та екології рослин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка, та в секторі фізіології та біохімії інтродукованих рослин Ботанічного саду ім. акад. О. В. Фоміна Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник – доктор біологічних наук, член-кореспондент УААН, Професор Мусієнко Микола Миколайович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри фізіології та екології рослин.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Кравець Володимир Степанович, Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, м. Київ завідуючий відділом фізіології стійкості кандидат біологічних наук Кожукало Валентина Євгенівна, Національний Аграрний Університет, м. Київ старший викладач кафедри фізіології рослин, вірусології та біотехнології.

 

 

Актуальність теми. Життєздатність рослинного організму в значній мірі залежить від факторів зовнішнього середовища. Температура – один із найважливіших для рослин лімітуючий фактор навколишнього середовища. Низькі температури несприятливо впливають на ріст та розвиток рослин (Поліщук, 1962, Проценко, 1964; Туманов, 1979; Kuroda, 1991; Willekens, 1995; Кравець, 1998). В умовах Лісостепу спостерігається вимерзання озимих зернових (до 30% посівів), викликаючи суттєві втрати врожаю. Тому зрозуміла увага, яка приділяється в Україні вивченню дії низьких температур на озимі зернові та фізіології їх зимостійкості.

Розробка фізіологічних методів підвищення стійкості рослин до низьких температур можлива лише на основі глибокого вивчення внутрішньої природи механізмів зимостійкості, що формуються в процесі адаптації до екстремальних факторів зовнішнього середовища (Андрєєва, 1988; Войников 1989; Guy, 1990; Стаценко, 1994; Houde, 1995).

Життєздатність будь-якого організму базується на ферментативних процесах, і особлива роль належить ферментним системам рослин у стійкості до низькотемпературного фактора (Петрова, 1985; Сарсенбаев, 1986; Савич, 1988; Perras, 1989; Schöner, 1990; Вовчук, 1991; Колупаев, 1993; Кучеренко, 1998). За дії низьких температур відбувається перебудова ферментативного апарату, націленого на можливість пристосування організму до існування в несприятливих умовах (Александров, 1984; Olien, 1985; Лютова, 1995).

Якісно нові можливості відкриває в цьому напрямку застосування молекулярно-генетичних маркерів. Дослідження механізмів зимостійкості з використання маркерних систем ізоферментного складу пероксидази дає можливість удосконалювати селекційний процес та давати оцінку зимостійкості селекційного матеріалу. Залежність між рівнем зимостійкості та трансформацією ізоферментного складу пероксидази потребує досконалого вивчення, і може виступати важливою ланкою у розширенні уявлень про формування адаптивних реакцій рослин до умов низькотемпературного стресу.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було з’ясування ролі активності, ізоферментного складу, рівня експресії генів пероксидази в механізмах формування стійкості озимих зернових до низькотемпературного стресу.

Для досягнення поставленої мети до завдань роботи входило:

1. Розробити якісний та швидкий фізіологічний метод прогнозування зимостійкості озимих зернових, що знаходяться на сортовипробуванні, за показниками сумарної активності пероксидази.

2. На основі розробленого експрес методу відібрати контрастні сорти та лінії озимих зернових для дослідження ізоферментного складу пероксидази.

3. Дослідити зміни ізоферментного складу пероксидази у різних за зимостійкістю сортів та ліній озимих зернових за оптимальних умов та за умов низькотемпературного стресу.

4. Підібрати олігонуклеотидні затравки до чотирьох генів пероксидази у озимих сортів і ліній та оптимізувати умови полімеразної ланцюгової реакції.

5. Дослідити експресію генів пероксидази за рахунок реакції зворотної транскрипції з використанням полімеразної ланцюгової реакції для з’ясування механізмів формування зимостійкості у досліджуваних сортів та ліній озимих зернових.

6. На основі результатів проведених досліджень розробити рекомендації за фізіологічними та біохімічними параметрами, що визначають ступінь зимостійкості озимих зернових, для відбору батьківських пар у селекційний процес, а також для ранньої діагностики сортового матеріалу.

Об’єкт дослідження – зимостійкість озимих зернових

Предмет дослідження – молекулярно генетичні маркери пероксидази за умов низькотемпературного стресу.

Методи дослідження – системний підхід у дослідженні реакції рослин на дію низьких температур, біохімічне визначення зміни активності пероксидази, електрофоретичний розподіл ізопероксидаз, дослідження регуляції генів пероксидаз з використанням RT-PCR.

Наукова новизна одержаних результатів. В лабораторних умовах була створена оригінальна модель експериментального загартування озимих зернових для попереднього їх скринінгу за ознакою зимостійкості.

Виявлена направлена зміна активності та ізоферментного складу пероксидази у озимих зернових, що мають різну зимостійкість, за умов низькотемпературного стресу.

З’ясовано особливості активності та ізоферментного складу пероксидази в клітинах зимостійких сортів за умов низькотемпературного стресу. Встановлено, що у зимостійких сортів жита Київське 9, пшениць Миронівська 808, Мирлебен зростає інтенсивність вже існуючих зон з ВЕР 0, 14; 0, 20 та з’являються нові компоненти з ВЕР 0, 23; 0, 69.

Вперше розроблена система диференційної напівкількісної детекції специфічних мРНК генів рох3 та рох4 у Tritiсum aestivum за умов низькотемпературного стресу, що рекомендовано як функціональний маркер зимостійкості рослин.

Вперше досліджено регуляцію генів пероксидази за умов низькотемпературного стресу з використанням методики RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction).

Досліджено та визначено рівень експресії генів пероксидази за рівнем мРНК у різних