Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

 

Ковтунович Геннадій Леонідович

 

УДК 577. 113. 5: 577. 152. 3

 

 

03. 00. 22- молекулярна генетика

 

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

 

Київ – 2002

 

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Козировська Наталія Олексіївна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу регуляторних механізмів клітини.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, член-кореспондент НАН України Мацелюх Богдан Павлович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, завідувач відділу генетики мікроорганізмів; кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Черепенко Олена Йосипівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної генетики.

 

 

Актуальність теми. Екологічна криза, що набуває все більш загрозливих масштабів, потребує термінових заходів по зменшенню техногенного навантаження на навколишнє середовище. Серед сфер людської діяльності величезний вплив на довкілля має сільськогосподарське виробництво. Інтенсивне використання мінеральних добрив, пестицидів та гербіцидів негативно впливає на стан довкілля та на загальний стан здоров’я населення.

Одним із шляхів виходу з даної ситуації є використання біопрепаратів комплексної дії на основі живих бактерій. Один із таких препаратів – “Клепс” було розроблено в нашому інституті, він пройшов повномасштабні випробування і добре зарекомендував себе серед сільськогосподарських товаровиробників. Позитивна дія даного препарату забезпечується реалізацією природних властивостей ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13, що має здатність до фіксації атмосферного азоту, синтезу гормонів росту рослин. Займаючи унікальну екологічну нішу у внутрішніх тканинах коренів, ці бактерії конкурують із місцевою патогенною мікрофлорою і запобігають ураженню кореневої системи рослин. У зв’язку з цим, актуальним є вивчення механізмів, що забезпечують взаємодію K. oxytoca VN13 з рослинами. Ці знання є необхідною передумовою для створення штучних штамів із заданими корисними властивостями.

K. oxytoca VN13 в кліматичних умовах України не виживає поза асоціацією з рослиною. Тому здатність до проникнення у внутрішні тканини коренів рослин є одним із основних факторів, що забезпечують ефективність даної бактерії. Але пошук біохімічних чинників та їх генетичних детермінант ускладнюється відсутністю чітких фенотипових ознак у бактерій та рослини- хазяїна, які б вказували на сам факт та інтенсивність колонізації, як це спостерігається при симбіотичній взаємодії бульбочкових рослин із представниками родини бобових. Однак, здатність K. oxytoca VN13 взаємодіяти з представниками небобових рослин та позитивний вплив на врожайність значної кількості сільськогосподарських культур робить актуальним дослідження в напрямку пошуку внутрішніх чинників, що впливають на цей процес та їх генетичних детермінант. Проведення досліджень в цьому напрямку надасть можливість направленої зміни властивостей даних бактерій та створення на основі генетично змінених штамів нових біопрепаратів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за бюджетною темою “Вивчення підходів до створення асоціації господарсько-цінних рослин з ендофітними бактеріями” (№ 2. 2. 4. 23).

Мета та завдання дослідження. Метою нашого дослідження було встановлення зв’язку між ефективністю внутрішньої колонізації коренів рослин бактерією K. oxytoca VN13 та функціонуванням системи пектинолізису цієї бактерії, а також окремих її компонентів; вивчення організації одного з генів пектинолізису та з’ясування його ролі в процесах взаємодії з рослинами. Також ми мали на меті розробити зручний та надійний метод ідентифікації K. oxytoca для спрощення виявлення цих бактерій в зразках різного походження. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

1. Виділити форми бактерій K. oxytoca VN13, що мають підвищену пектолітичну активність та визначити їх здатність до внутрішньої колонізації коренів рослин порівнянно з вихідим типом.

2. Створити плазмідний банк генів K. oxytoca VN13 та клонувати ген (гени) пектинолізису в Escherichia coli.

3. Визначити нуклеотидну послідовність клонованого гена та вивчити його структуру.

4. Створити мутант з інактивованим пектиназним геном та дослідити значення клонованого гена в процесах катаболізму пектину та взаємодії K. oxytoca VN13 з коренями рослин.

5. Використовуючи фрагменти клонованої ДНК з унікальною послідовністю нуклеотидів, розробити праймери та відпрацювати методику ідентифікації K. oxytoca за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Об’єктом дослідження були молекулярно-генетичні механізми взаємодії ендофітних бактерій з рослинами, а предметом дослідження-роль екзополігалактуронази в процесах інтеграції цих бактерій у внутрішні тканини кореня рослини.

Для досягнення поставленої мети викостовували такі методи як клонування генів у плазмідному векторі, направлений мутагенез in vitro та заміщення нативного гена на мутантний in vivo, визначення і комп’ютерний аналіз нуклеотидної послідовності гена та виведеної амінокислотної послідовності.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що, в результаті виконання даної роботи, вперше було встановлено зв’язок між рівнем пектиназної активності ендофітних бактерій та інтенсивністю колонізації внутрішніх тканин коренів рислин. Вперше було клоновано ген екзополігалактуронази (pehX) K. oxytoca, визначено його нуклеотидну послідовність та проаналізовано кодований ним поліпептид