Зміни кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при діабетичній нейропатії

Теоретичне і практичне значення роботи. Результати одержаних досліджень мають, як теоретичне так і практичне значення. Краще розуміння механізмів порушення Ca2+ гомеостазу в вторинних сенсорних нейронах за умов викликаного діабету, значно розширює розуміння перебігу та патогенезу діабетичних нейропатій.

Істотне практичне значення мають дані про те, які саме механізми підтримання внутрішньоклітинного кальцієвого гомеостазу зазнають змін за умов діабетичної нейропатії. Цілком ймовірно, що речовини, які нормалізують функціонування внутрішньоклітинних кальцієвих насосів, чи блокатори кальцієвих каналів, внесок яких у генерацію, викликаних деполяризацією, [Ca2+]i транзиєнтів збільшується за умов діабету, можна буде використовувати при лікуванні сенсорних нейропатій у людини.

Особистий внесок здобувача. Дослідження змін кінетичних характеристик, викликаних деполяризацією, Ca2+ транзієнтів а також внеску потенціал-керованих кальцієвих каналів за умов стрептозотоцин-індукованого діабету, проводилися автором особисто. Експерименти по визначенню змін функціонування внутрішньоклітинних кальцієвих депо за умов стрептозотоцин-індукованого діабету та дослідження змін терморецепції у щурів з експериментальним діабетом проводилися спільно з аспірантом Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця – Шутовим Л. П. Експерименти по визначенню змін больових реакцій щурів при формаліновому тесті проводилися спільно зі старшим науковим співробітником Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця – к. б. н. Сушко Б. С. Опрацювання, статистичний аналіз та узагальнення усіх результатів проводилися автором самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи доповідались на наступних наукових конференціях: 29й щорічній конференції Спілки Нейронаук, Майамі, США, 1999; 44й щорічній конференції Біофізичного Товариства, Новий Орлеан, США, 2000; спільному “Богомолець-Ненскі” Симпозіумі, Сулєєв, Польща, 2001; 34м міжнародному Конгресі фізіологічних наук, Крайстчерч, Нова Зеландія, 2001, 31й щорічній конференції Спілки Нейронаук, Сан-Франциско, США, 2001; Розширеному семінарі по нейронаукам, Прага, Чехія, 2001; Також результати роботи були представлені на семінарах Сектору молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України (1999-2001 роки). За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті та 8 тез.

Обсяг та структура дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел, який включає 224 найменування. Дисертаційна робота викладена на 130 сторінках (не включаючи списку використаних джерел) та ілюстрована 29 рисунками.

Метод «формаліновий тест». Даний метод використовується для дослідження поведінкових реакцій тварин при гострому болі. Ноцицептивний стимул викликали підшкірним введенням 20 мкл 5% розчину формаліну в задню лапу контрольних та діабетичних тварин. Протягом наступних півтори години поведінкові реакції кожної тварини (переміщення, споживання їжі та води, лизання та посмикування ушкодженої кінцівки) реєстрували з використанням комп'ютера.

Метод «гаряча поверхня». Даний метод дозволяє вивчати больові реакції щурів на термічний стимул, а також визначати поріг больової температурної чутливості. Для створення ноцицептивного стимулу експериментальну тварину поміщали на поверхню розігріту до температури, яка здатна викликати розвиток больової реакції. Після того, як експериментальні тварини були поміщені на поверхню з заданою температурою, починався відлік часу до появи характерної больової реакції – лизання задніх кінцівок.

Одержання зрізів спинного мозку Тонкі зрізи спинного мозку готували за методом Рандіч та співавторів (Randic M. et al. 1993). Експерименти проводили на щурах лінії Wistar віком 6-7 тижнів. Під глибокою ефірною анестезією, проводили операцію розкриття оболонок спинного мозку, та видаляли люмбо-сакральну ділянку спинного мозку (сегменти L4 -S1). Безпосередньо після видалення, спинний мозок поміщали в охолоджений до 4° С інкубаційний розчин, який постійно оксигенували сумішшю 5% CO2 + 95% O2. Після очищення, спинний мозок прикріплювали до предметного столика вібротома (Campden Instruments LTD, Англія) де виготовляли його тонкі (300 мкМ) зрізи.

Фарбування клітин флуоресцентним барвником. Для кількісного визначення концентрації кальцію в нейронах дорзального рога спинного мозку використовували мембранно-проникну форма барвника фура-2 (фура- 2/АМ). Для введення кальцій – чутливого зонда в клітини, тонкі зрізи спинного мозку поміщали в базовий розчин, який містив естерифіковану незаряджену форму барвника в концентрації 5 мкмоль/л, розчинену в диметилсульфоксиді з додаванням детергенту Плуронік F-127 (0. 02%). Зріли фарбували протягом 50 хвилин при температурі 35о С та постійному оксигенуванні атмосфери, що оточує розчин зі зрізами, сумішшю 5% CO2 + 95% O2. Після фарбування зрізи переносили в базовий розчин, в якому їх додатково витримували протягом 40 хв. для повної деестерифікації зонда фура-2/АМ.

Флуоресцентна кальційметрія. Флуоресцентний сигнал реєстрували на довжинах хвиль 360 та 390 нм. Реєструючи відносну зміну інтенсивності флуоресценції при збудженні двома довжинами хвиль, можна розрахувати [Ca2+]i у клітинах за формулою, яка була запропонована Грінкевичем і співавторами в 1985 р. (Grynkiewicz G. et al. 1985) :

[Ca2+]i = Kd • b • (R – Rmin) / (Rmax – R)

Значення констант, що входять у рівняння одержані внаслідок калібрування склали: Rmin= 0. 9; Rmax= 19 і b= 26. Параметр Кd, взятий з роботи Грінкевича [145], становив 224 нмоль/л.

Експериментальна установка для двохвильового вимірювання концентрації цитозольного кальцію. Основними елементами установки є: джерело світла, система зміни фільтрів, мікроскоп, фотоелектронний помножувач (ФЕП), модуль попередньої обробки сигналу та комп'ютер. Як джерело збуджуючого світла використовували ртутну лампа потужністю 50 ват. Періодична зміна фільтрів для збудження флуоресценції здійснювалась за допомогою обертання колеса з двома інтерференційними фільтрами з максимумами пропускання 360 і 390 нм. Частота обертання колеса складала 5 Гц. Керування системою