Одержання, характеристика та використання ферментів отрути Щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys)

Субстратну специфічність активатора протеїну С досліджували, використовуючи ефіри амінокислот, хромогенні субстрати, білки і проферменти. Фермент не виявляв БАПНА і ТАМЕ естеразну активність, але гідролізував БАЕЕ. Активність складала 520 мкмолей/хв на 1мг білка. Препарат не гідролізував хромогенні субстрати плазміногена (S2251), фактора Х (S2765), фактора Ха (S2222), урокінази (S2444), але виявляв незначну амідазну активність на субстраті тромбіну (S2238). Фермент не мав казеїнолітичної і фібринолітичної активності, не діяв на протромбін, фібриноген, плазміноген, тромбін, не впливав на агрегацію тромбоцитів, що подібно до властивостей активатора протеїну С, виділеного з отрути Agristrodon contortrix contortrix.

Активність ферменту пригнічувалась інгібіторами серинових протеїназ – ДФФ, бензамідином, ПМСФ, етилен-диамін-тетраацетатом (ЕГТА) і не інгібувалась гірудином, синтетичним інгібітором тромбіну, соєвим інгібітором трипсину (СІТ), гепарином. Не були ефективними також інгібітори цистеїнових і кислих протеїназ – 0, 1 мМ ПХМБ, 10 мМ хлорацетамід (таб. 2). Ці дані дозволяють зробити припущення про наявність в активному центрі ферменту серина.

Отже, за даними DS-Na електрофореза отриманий білок є одноланцюговим, з молекулярною масою 3кДа. Оптимум рН дії отриманого ферменту – при 8, 0. Для активації протеїну С виділеним активатором не потрібні тромбін, тромбомодулін і кальцій. Фермент не втрачає активності при ліофілізації і наступному збереженні у замороженому стані при -20оС. Легко розчинний у воді.

 

Таблиця 2. Вплив інгібіторів серинових протеїназ на активність активатора протеїна С

Інгібітори Концентрація інгібіторів Залишкова активність, % 

Бензамідин 10 мМ 48

ЕДТА-Nа 20 мМ 97

ПМСФ 200 мМ 22, 5

ПНГБ 10 мМ 30

ПНГБ 100 мМ 0

АТ-III/гепарин 60 мкМ/4 од/мл 100

СІТ 1 мг/мл 100

ДФФ 10 мМ 0

 

Виділення інгібітору агрегації тромбоцитів

Інгібітор агрегації тромбоцитів одержували на Q-сефарозі. Як і для фібриногенолітичного ферменту, активатора протеїну С, вихідним матеріалом була білкова фракція, що не зв'язалася з блакитною сефарозою при видаленні з отрути тромбіноподібного ферменту. При використанні ступінчатого градієнта NaCl з Q-сефарози при іонній силі 0, 04 М і 0, 08 М елюювались, відповідно, активатор протеїну С і фібриногенолітичний фермент. Інгібітор агрегації тромбоцитів елюювався при іонній силі 0, 2 М (фракція 8, рис. 2А). За даними DS-Na електрофореза це одноланцюговий пептид з молекулярною масою 14 кДа. Дію на АДФ-залежну агрегацію тромбоцитів перевіряли, додаючи різні кількості отриманого препарату до збагаченої тромбоцитами фракції плазми крові. Швидкість агрегації реєстрували на агрегометрі Apact (Німеччина). Проведені дослідження показали, що під дією внесеного препарату швидкість агрегації знижується (рис. 6). Очевидно, отриманий білковий препарат блокує тромбоцитарний рецептор фібриногену – інтегрин IIbIIIa, однією з функцій якого є участь у взаємодії тромбоцит-тромбоцит і тромбоцит-стінка судини.

Вивчення порушень стану системи гемостазу

Система гемостазу, з фізіологічної точки зору, являє собою взаємодію двох протилежних систем – системи зсідання крові та фібринолітичної. Порушення цілісності гемостазу веде до виникнення внутрішньосудинного зсідання крові (ВЗК-синдром). Для лабораторної діагностики ВЗК, особливо його хронічної форми, важливо використання високочутливих діагностичних тестів, за допомогою яких можна виявити маркери ВЗК-синдрома і характеризувати ступінь порушення балансу між окремими ланками гемостазу.

Ферменти-активатори фібриногену, протромбіну, протеїну С, що виділені з отрути щитомордника звичайного і ефи багатолускової, можуть бути використані як для досліджень процесу тромбоутворення на модельних системах, так і для діагностичних цілей у клінічній практиці. Розроблений на їхній основі комплекс діагностичних тестів дозволяє характеризувати стан системи гемостазу при різних патологіях, а також вчасно виявити порушення рівноваги між окремими ланками гемостазу. Тести апробовані на плазмі крові хворих при захворюванні серцево-судинної системи, виразкової хвороби, нефритах, гестозах при вагітності та ін. ; високочутливі, інформативні, легко здійсненні, не вимагають додаткового устаткування.

Застосування активатора протеїну С для визначення рівня протеїну С у плазмі крові

У клінічній практиці для встановлення рівня одного з основних фізіологічних інгібіторів процесу активації системи зсідання крові – протеїну С – у плазмі крові використовували функціональний тест „активований частковий тромбопластиновий час” (АЧТЧ) із застосуванням нефізіологічних активаторів протеїну С. Активований протеїн С інактивує Va і VІІІа фактори, внаслідок чого час зсідання в тесті значно подовжується. Рівень активності протеїну С визначають за калібрувальним графіком, побудованим з використанням дефіцитної за протеїном С плазми. При розробці умов тесту для визначення рівня протеїну С за допомогою ферменту-активатора, виділеного з отрути щитомордника експериментально визначали тривалість інкубації та оптимальну кількість ферменту, що повністю активує протеїн С у відповідному об’ємі плазми крові і викликає таке збільшення часу зсідання при використанні теста АЧТЧ, коли чутливість тесту максимальна. Оптимальний (контрольний) час зсідання плазми крові складає 180 с.

При деяких патологіях внаслідок накопичення в кровотоці патологічних інгібіторів зсідання крові час зсідання в тесті АЧТЧ значно подовжується. Крім того, у хворих зі схильністю до тромбозів виявляють спадкову або надбану форму резистентності фактора Va до дії активованого протеїну С (РАПС), що обумовлено крапковою мутацією гена фактора V (аномалія фактора V Лейден). Основою надбаної форми є порушення взаємодії фактора Vа, протеїну С з протеїном S на фосфоліпідній мембрані. Ця форма РАПС виявляється при вагітності, антифосфоліпідному синдромі (Sakata et al.,