Дослідження властивостей генноінженерних білків – потенційних компонентів вакцин

 

 

Досягнення молекулярної біології і генетики дозволили цілеспрямовано маніпулювати фрагментами нуклеїнових кислот і отримувати різні комбінації спадкового матеріалу. В основі цих досягнень лежать універсальність генетичного коду, можливість отримувати в ізольованому вигляді фрагменти генів і нуклеїнових кислот, синтезувати ex vivo фрагменти нуклеїнових кислот і об'єднувати їх в єдине ціле [7].

Таким чином, зміна спадкових властивостей організму за допомогою генної інженерії зводиться до конструювання з різних фрагментів нового генетичного матеріалу, введення цього матеріалу в реципіентний організм, створення умов для його функціонування і стабільного спадкування [7]. Створення генно-інженерних вакцин зводиться до цілеспрямованого отримання рекомбінантних бактерій або вірусів, нешкідливих для макроорганізму володіючих високою імуногенністю та активуючих тривалий протективний імунітет. Можлива зворотня ситуація – штучне аттенуювання, коли з генома бактерії або вірусу видаляють фрагменти ДНК, що визначають їх вірулентність і патогенність [2, 3]. При збереженні протективних властивостей штучно атенуйовані бактерії і віруси можуть бути вакцинними препаратами або слугувати основою для отримання рекомбінантних вакцин. Крім того, генно-інженерна технологія дозволяє отримувати рекомбінантні суб'единичні вакцини, які виділяються в зовнішнє середовище штамами продуцентами – дріжджовими клітинами або Е. coli [12].

Існує кілька методів отримання генно-інженерних конструкцій. Найбільшого поширення набули плазмідна технологія клонування генів і фаговий метод. При клонуванні генів цільовий фрагмент ДНК, який контролює утворення певних білків, виділяють, вводять в різні бактерії і розмножують (ампліфікують). Завдяки клонуванню генів з'явилася можливість отримувати у великих кількостях білки, що визначають вакцинну конструкцію [30]. Ця технологія заснована на такому принципі: крім своєї власної кільцевої хромосоми, бактерії часто містять плазміди. Плазмідну ДНК можна виділити і розщепити відповідною рестриктазою тільки в одному сайті, перетворивши кільцеву молекулу в лінійну, з «липкими» кінцями. Далі фрагменти будьякої чужорідної ДНК з такими ж липкими кінцями можна зшити з плазмідної ДНК за допомогою лігази. Рекомбінантну конструкцію вводять потім у бактерію, де вона реплікується. При отриманні рекомбінантних вакцин в якості джерела екзогенної ДНК можна використовувати бактеріальну, вірусну ДНК, а також ДНК, отриману з клітин людини, або штучно синтезовані гени [2, 7].

Крім бактеріальних плазмід в якості векторів (носіїв) ДНК використовують фаги. Частина геному цього фага не обов'язкова для його розмноження в бактерії. Замість нього можна ввести чужорідну ДНК, яка буде розмножуватися разом з фаговою після інфікування бактерій [7].

Для створення векторних живих вірусних вакцин використовують атенуйований ДНК-вірус, в геном якого вбудовується необхідний клонований ген. Вірус – носій вектора – активно розмножується, а продукт вбудованого гена забезпечує формування імунітету. Вектор може містити кілька вбудованих генів, що відповідають за транскрипцію і трансляцію відповідних чужорідних антигенів [12].

За принципами конструювання і носія вектора рекомбінантні вакцини можуть бути розділені на обмежене число груп:

1) генно-інженерні білкові рекомбінантні конструкції;

2) гетерологічні бактерії або віруси, які використовуються як носії відповідних векторів;

3) штучно атенуйовані, високоімуногенні штами, що містять протективні антигени, з генома яких вилучені гени, що визначають вірулентність і токсичність;

4) вірусоподібні конструкції, позбавлені генома;

5) генетичні конструкції що включають імуногенну складову і компонент, що визначає інші властивості.

 

Генно-інженерні рекомбінантні конструкції, з одного боку, самі можуть бути досить ефективними вакцинами і, з іншого боку, створення таких конструкцій є етапом для побудови вектора і отримання живої атенуйованої вакцини. Зокрема, для профілактики туберкульозу використовували генно-інженерну конструкцію з двох секретуємих у середовище протективних антигенів – А85 і Е8АТ6. Генно-інженерна конструкція, Е8АТ6-85В, в поєднанні з синтетичним ад'ювантом 1С31 викликала у мишей і мавп тривалу імунну відповідь і захищала від аерозольного зараження [44]. Надалі її використовували для отримання живої атенуйованої вакцини гВСО-Е8АТ6-85В [54].

Гетерологічні бактерії або віруси, які використовуються як носії відповідних векторів

При конструюванні вакцин на основі вірусів найбільш часто використовують аденовірус людини серотипу 5, аденовірус шимпанзе серотипу 63 (АД5, 63), вірус везикулярного стоматиту (ВВС) і цитомегаловірус (ЦМВ) [37].

Вакцинація проти Р. falciparum знизила захворюваність і смертність серед дітей у віці до 5 років. В даний час використовують конструкції на основі серотипу АД5. Крім того, сконструйована вакцина на основі не реплікуючогося в людському організмі аденовірусу шимпанзе серотипу 63 [38].

Спочатку АД5 використовувався як терапевтичний трансген для лікування генетичних дефектів [46]. Однак унікальна здатність АД5 викликати стійку імунну відповідь навіть при імунодефіцитних станах зробила АД5 дуже привабливим для створення на його основі векторів для генно-інженерних вакцин [33], зокрема для профілактики геморагічної лихоманки, викликаної вірусом Ебола (ЕБОВ). Вакцинація рекомбінантної конструкцією АД-ZGP [глікопротеїн оболонки Zaire ebolavirus (ZEBOV) ] мишей, морських свинок і шимпанзе викликала стійкий прогектівний ефект при летальному зараженні [46, 38, 54]. Проводились клінічні випробувань на добровольцях. Отримані дані показали високу імуногенність вакцини NCT00374309 [29].

Атенуйований штам ВВС традиційно служив вектором для створення рекомбінантних вакцин, використовувався в якості основи для експресії поверхневого глікопротеїну ЕБОВ. Дану конструкцію використовували в експерименті на лабораторних тваринах як в профілактичних, так і