Ізоферментний склад пероксидази озимих зернових за умов низькотемпературного стресу

Експресію генів пероксидази рох 1, рox 2, рox 3, рox 4 досліджувала за рахунок ампліфікації продуктів, отриманих на мРНК матриці за допомогою реакції зворотної транскрипції RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) з використанням праймерів, що вироджені в деяких позиціях, щоб їхні послідовності задовольняли умовам компліментарності усіх чотирьох генів пероксидази: рох1 1). 5‘-ссttcgcgacatctctcagggcca-3‘, 2). 5‘-ctggtccgagtgcaggagccctt-3‘, рox2 1). 5‘-ссttcgcgacgtctctcaaggcca-3‘, 2). 5‘-ctggtccgagtgcaggagccttt-3‘, рox3 1). 5‘-ссttcgccacatctctcagggcca-3‘, 2). 5‘-ctggtccgagtgcaggagccctt-3‘, рox4 1). 5‘-ссttcgcaacatctctcagggcca-3‘, 2). 5‘-ctggtcggagtgcaggagccctt-3‘.

Олігонуклеотидні затравки були синтезовані за допомогою фосфораметидного методу на синтезаторі “Applaid biosistem” та очищені за допомогою гель-електрофорезу в 20% акриламіді та знесолені за допомогою гельфільтрації з використанням Toyеperl HW-40.

Реакцію зворотної транскрипції проводили протягом 1 години при 370С з використанням зворотного праймеру 5‘-ctggtc (c/g) gagtgcaggagccc (c/t) tt-3‘. Отриману кДНК ампліфікували в ампліфікаторі “Perkin Еlmer 2400” протягом 35 циклів: денатурація 940С 20 сек., асоціація праймерів 670С 20 сек., синтез 720С 10 сек (). Отримані продукти детектували в 10% акриламідному гелі за допомогою горизонтального електрофорезу в трісборатному буфері. Гель після електрофорезу фарбували бромистим етидієм (1мкг/мл). Фрагменти спостерігали за допомогою ультрафіолетового транслюмінатора (Маниатис, 1985).

Біологічна повторність дослідів 3-4-х кратна, аналітична – 9-ти кратна. Результати оброблені статистично з використанням загальноприйнятих методик (Доспехов, 1985).

 

 

Прогнозування зимостійкості озимих зернових за показниками активності пероксидази. Як відомо при дії низькотемпературного стресу у рослини відбуваються процеси адаптації, що полягають у зниженні термостабільності функцій та зростанні числа функціональних одиниць (Александров, 1984). Тобто відбувається зростання інтенсивності дихання для створення високого енергетичного потенціалу, що спричиняє утворення в ЕТЛ супероксидних радикалів, дія яких призводить до “окислювального стресу” у клітині. У відповідь не це у зимостійких сортів зростання сумарної активності пероксидази зумовлене змінами властивостей ферменту, викликаного адаптивними змінами генотипової та модифікаційної природи.

На основі виявленої закономірності чітко проявляється маркерна функція пероксидази у процесах формування зимостійкості, яка була взята за основу розробленого та запатентованого методу прогнозування зимостійкості озимих зернових.

Щоб здійснити попередній скринінг генотипів озимих зернових, що знаходяться на сортовипробуванні, ми застосували розроблений та запатентований нами спосіб прогнозування зимостійкості рослин за показниками активності пероксидази за різних температурних режимів. Нами було дано оцінку зимостійкості 70 сортам, гібридам, лініям озимих злаків (жито, пшениця, тритикале). Паралельно були проведені польові досліди. Одержані дані співпадають зі станом перезимівлі у вегетацію 1996/1997 та 1997/1998 років (рис. 1).

 

 Рис. 1. Порівняльні показники зимостійкості озимих зернових за даними пероксидазного аналізу та наслідками перезимівлі в природних умовах (1996/1997)

 

1. жито Київське 9; 2. пшениці Миронівська 808; 3. Мирлебен; 4. Миронівська 61; 5. Кінельська 9; 6. лінія № 11004-96; 7. лінія № 11014-96; 8 лінія № 11071-96; 9. лінія № 1130-95; 10. ПС 144-97; 11. Миронівська 33; 12. Миронівська 29; тритикале 13. Поліська 1; 14. амфідиплоїд 55/96; 15. ПТ-384; 16. ПТ-488; 17. ПС 154-97; 18. ПС 178-97; 19. ПС 102-97; 10. ПС 103-97

Рослини, що вимерзли в цей період мали відношення активності пероксидази при оптимальній температурі (21-230С)  (Аопт.) до активності при стресі (Ахол) менше одиниці, що корелює (ρ≈0, 9208) з низькою ферментативною активністю пероксидази. Рослини з задовільною зимостійкістю мали співвідношення пероксидази за різних температурних режимів Ахол/Аопт більше одиниці, тобто їх пероксидазна система здатна протистояти низькотемпературному стресу.

Зима 1997/1998 років теж характеризувалась екстремальними умовами перезимівлі: відносно тепла осінь (середня за місяць в листопаді 2, 50С при нормі 0, 80 С), велика сума опадів в зимові місяці (грудень 205% від норми, січень – 111%, лютий – 106%), та коливання температур від низьких позитивних (в других декадах грудня 2-4оС, січня 3-50С) до екстремальних (кінець грудня, третя декада січня -100С). Озимі зернові не пройшли процеси яровизації, що відбуваються при низьких температурах (-1, +20С…+60С). В свою чергу відносно велика сума опадів в зимові місяці та коливання температур сприяли випріванню та вимоканню озимих зернових. Тому не дивно, що зразки, відібрані після несприятливої зими 1996/1997 рр. з екстремальними умовами при застосуванні пероксидазного аналізу показали задовільну зимостійкість (Рис. 2).

 

Рис. 2. Порівняльні показники зимостійкості озимих зернових за даними пероксидазного аналізу та наслідками перезимівлі в природних умовах (1997/1998)

 

1. пшениці Миронівська остиста; 2. Кримська 10; 3. Поліська 90; 4. Поліська 90-167; 5. Поліська 90-209; 6. Тіра 6112-96; 7. лінія № 11041-96; 8. лінія № 11045; 9. лінія № 11061-96; 10. лінія № 11166-96; 11 лінія № 11225-96; 12 лінія № 11253-96; 13. тритикале: амфідиплоїди 56/96; 14. – 58/96; 15 – 59/96; 16 – 3/5; 17. ДR 265; 18. ДR 358; 9. ДR 371; 20. ПТ-387

За результатами попереднього скринінгу були відібрані 25 батьківських пар в селекційний процес за ознакою зимостійкості: а саме лінії пшениці № 11041-96, № 11045, № 11061-96, № 11166-96, № 7020-97, № 7044-97, № 1788-97, № 1087-97,