Ізоферментний склад пероксидази озимих зернових за умов низькотемпературного стресу

Таким чином, за компонентним складом пероксидази у озимих сортів та ліній зернових (ячмінь, жито, пшениця, амфідиплоїди), за умов низькотемпературного стресу можна характеризувати зимостійкість досліджуваних сортів. На основі цих даних може бути розроблений метод прогнозування зимостійкості генотипів озимих зернових за зміною ферментативної активності лужних ізоформ пероксидаз з ВЕР 0, 14; 0, 20 та появою нової зони з ВЕР 0, 23 у випадку жита.

Дослідження рівня експресії генів пероксидази за умов низькотемпературного стресу. Як відомо, зростання активності ферменту може бути обумовлене багатьма причинами. Одна з них – це та, що активність ферменту може зростати за рахунок його адаптаційних модифікацій, інша – за рахунок зростання кількості молекул, тобто зростання рівня експресії генів або генетичної адаптації.

Подальшою метою нашої роботи було з’ясування механізмів формування генетичної адаптації у зимостійких сортів Миронівська 808 та Мирлебен. Для цього нами було залучено сучасні технології кількісної детекції специфічних нуклеїнових кислот, зокрема мРНК, що кодують фермент пероксидазу.

В дослідженнях, що були проведені за останні роки показано, що адаптація рослин до дії низьких температур, яка супроводжувалася підвищенням зимостійкості, тісно пов’язана зі змінами в експресії генів (Guy, 1990; Thomashow, 1993; Ouellet, 1993). Найчастіше ці зміни під дією температур призводять до появ нових зразків мРНК і накопичення специфічних білків (Durham, 1991; Войников, 1991; Limin, 1995; Gana, 1997; Vazquez-Tello, 1998).

У наших дослідженнях також виявлено кореляцію між рівнем мРНК генів пероксидази та ступінню зимостійкості сортів та ліній пшениці. При проведенні нами полімеразної ланцюгової реакції для дослідження рівня експресії генів пероксидази у сортів та ліній пшениці за оптимальних умов та за умов низькотемпературного стресу було детектовано 2 продукти ампліфікації. Ці продукти реакції з молекулярною масою 146 та 152 п. н., спостерігаються у всіх сортів та ліній пшениці. Вони відповідають теоретично передбаченим фрагментам мРНК генів пероксидази рох3 та рох4, що свідчить про універсальний характер експресії цих генів у проростках озимих сортів та ліній пшениці.

При проведенні електрофорезу продуктів після 30 циклу ампліфікації на електрофореграмі у всіх варіантах за оптимальних умов (22-250С) та за умов низькотемпературного стресу (-1-20С) ми спостерігаємо напрацювання продуктів із молекулярною масою 145 та 151 п. н., але у зимостійких сортів кількість напрацьованого продукту у випадку стресу була більшою (рис. 8).

Умовні позначки: 1. 10. Маркери мол. маси φХ 174/НаеІІІ. 2. Миронівська 808 за оптимальних умов. 3. Миронівська 808 за умов низькотемпературного стресу. 4. Мирлебен за оптимальних умов. 5. Мирлебен за умов низькотемпературного стресу. 6. Лінія № 11004-96 за оптимальних умов. 7. Лінія № 11004-96 за умов низькотемпературного стресу. 8. Лінія № 11014-96 за оптимальних умов. 9. Лінія № 11014-96 за умов низькотемпературного стресу.

При порівнянні результатів отриманих нами з аналогічними інших авторів, ми приходимо до висновку, що більші рівні експресії генів за умов низькотемпературного стресу мають зимостійкі сорти. Так, при дослідженні рівня експресії гена tarc7 у тканинах злаків двох генотипів, що відрізняються за зимостійкістю [Кравець 30], були використані два мутанти озимої пшениці – Sdmut16029 з високим рівнем зимостійкості та Sdmut16169 – із низьким. Порівняння експресії гена tarc7 за низьких температур у двох вказаних генотипів виявило більш високий рівень у зимостійких форм. Найбільша відмінність в експресії дослідженого гена виявлена через 3 тижні росту рослин за температури 20С.

Таким чином, за результатами наших досліджень у зимостійких сортів Миронівська 808 та Мирлебен за умов низькотемпературного стресу сумарна активність пероксидази зростала за рахунок зростання рівня експресії генів рох3 та рох4, а у незимостійких ліній зростання рівня експресії генів за тих же умов ми не спостерігали. Отже, стійкість сортів озимих зернових до умов низькотемпературного стресу слід розглядати як генетично детерміновану ознаку.

Стійкість рослин до негативних факторів визначається складними регульованими генетичними системами. Зміни рівнів експресії генів рох3 та рох 4, визначені нами для деяких сортів та ліній пшениць, за дії низьких температур також займають певне місце серед механізмів адаптації, визначаючи фізіологічний стан рослин, впливаючи на метаболізм, стійкість, ріст та розвиток.

Розроблена нами система диференційної напівкількісної детекції специфічних мРНК генів рох3 та рох4 у Tritiсum aestivum за умов низькотемпературного стресу може бути застосована як функціональний маркер зимостійкості рослин.

 

 

1. Встановлено, що окремі типи спектру пероксидази за умов низькотемпературного стресу можуть бути фізіологічними маркерами, що беруть безпосередню участь в адаптації рослин до умов низькотемпературного стресу. У зимостійких озимих сортів жита Київське 9, пшениць Миронівська 808, Мирлебен за умов низькотемпературного стресу зростає інтенсивність вже існуючих зон із ВЕР 0, 14; 0, 20 та з’являються нові компоненти з ВЕР 0, 23; 0, 69.

2. Вперше було досліджено рівень експресії генів пероксидази за рівнем мРНК, у різних за зимостійкістю озимих зернових за умов низькотемпературного стресу. У сортів та ліній пшениці чітко спостерігаються продукти ампліфікації з молекулярною масою 146 та 152 п. н., що відповідають фрагментам мРНК генів пероксидази рох3 та рох4.

3. У зимостійких сортів за умов низькотемпературного стресу зростає сумарна активність пероксидази, яка у свою чергу пов’язана зі зростанням рівня експресії генів.

4. В лабораторних умовах були змодельовані та підібрані умови експериментального загартування для озимих зернових різних культур, що знаходяться на етапі конкурсного сортовипробування в Інституті Землеробства УААН (с. м. т. Чабани).

5. Запропоновано метод визначення зимостійкості озимих зернових, що базується на встановленні співвідношення активності пероксидаз за оптимальних умов (Аопт), та за умов дії низьких температур (Ахол). Рослини тих сортів та ліній, в яких співвідношення Ахол/Аопт більше одиниці – зимостійкі, а сорти та лінії, що мають співвідношення Ахол/Аопт менше або рівне одиниці, неспроможні протистояти дії низьких температур, тому характеризуються низькою зимостійкістю.

6. Проведено попередній скринінг 70 сортів, гібридів та ліній озимих злаків (жито, пшениця, тритикале) на зимостійкість. Було виявлено 24 зимостійкі лінії та гібриди озимих зернових, що можуть бути відібрані в селекційний процес за ознакою зимостійкості. Зимостійкими виявились: пшениці – Миронівська 808, Мирлебен, Миронівська 33, Миронівська 29, Миронівська остиста, Кінельська 9, Поліська 90, лінії № 11041-96, № 11045, № 11061-96, № 11166-96, № 7020-97, № 7044-97, № 1788-97, № 1087-97, № 1114-97, № 1585-97; тритикале – 58/96, 59/96, 3/5, ДR 265, ДR 358, ДR 371, CP 14, CR 15, CR 16, CR 27, ПС 160-97, ПС 127-97, ПС 136-97, ПС 155-97.

7. Розроблена система диференційної напівкількісної детекції специфічних мРНК генів рох3 та рох4 у Tritiсum aestivum за умов низькотемпературного стресу може бути застосована як функціональний маркер зимостійкості рослин.

8. У пристосуванні рослин до низькотемпературного стресу адаптація може відбуватися за рахунок генотипічних механізмів (експресія генів, що включає в себе зміну первинної структури ферменту, а також посттрансляційні хімічні перебудови) та модифікаційних механізмів (конформаційні перебудови).

 

 

Кучеренко В. П., Капустян А. В., Шередеко Л. М. Прогнозування зимостійкості озимих зернових за показниками активності пероксидази // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Інтродукція та збереження рослинного різноманіття”. – 1999 – 2. – С. 72-73.

Капустян А. В., Кучеренко В. П., Мусієнко М. М. Вплив низькотемпературного стресу на активність пероксидази проростків пшениці // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Біологія”. – 1999. – 29. – С. 43-45.

Капустян А. В., Кучеренко В. П. Зміна ізопероксидазного спектра проростків жита при низькотемпературному стресі // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Інтродукція та збереження рослинного різноманіття”. – 2000 – 3. – С. 61-63.

Капустян А. В., Кучеренко В. П., Мусієнко М. М. Зміна ізопероксидазного складу сортів ячменю при низькотемпературному стресі // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Біологія”. – 2000. – 30. – С. 83-85.

Капустян А. В. Фермент пероксидаза – універсальний маркер зимостійкості рослин // Інтродукція рослин. – 2000. – №1. – С. 152-154.

Кучеренко В. П., Капустян А. В. Пероксидаза – маркерний фермент низькотемпературного стресу стресі // Вісник Київського університету імені Тараса Шевченка. Серія “Інтродукція та збереження рослинного різноманіття”. – 2001 – 4. – С. 65-69.

А. с. 98073930 А 01 Н ¼. Кучеренко В. П., Капустян А. В., Шередеко Л. М. Мусієнко М. М. “Спосіб прогнозування зимостійкості озимих зернових”. № 32911А від 15. 02. 01. р.

Капустян А. В. Прогнозування адаптаційної здатності у Hordeum vulgare L. Матеріали з’їзду Х Українського ботанічного товариства // Київ-Полтава, – 1997. – С. 133.

 

 

Капустян А. В. Ізоферментний склад пероксидази озимих зернових за умов низькотемпературного стресу. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 12 – фізіологія рослин. – Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Ключові слова: Triticum аestsvum, низькотемпературний стрес, ізоферменти, зимостійкість, адаптація, пероксидаза, експресія генів.