Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику

Крім відкривання катіонних каналів активація мускаринових рецепторів викликає також модуляцію потенціалкерованих Ca2+ каналів L-типу. Раніше повідомлялося, що пригнічення ICa у ГМК ileum морської свинки не чутливе до коклюшного токсину (Unno et al. 1995). За фізіологічних умов пригнічення ICa, поряд з активацією гіперполяризуючого IK (Ca) при вивільненні Ca2+ і десенситизації IКАТ може служити ще одним важливим адаптивним і захисним механізмом для обмеження входу Ca2+ у клітину при холінергічній деполяризації.

Метою даних досліджень було з'ясування участі G-білків і порівняння ефектів КХ у відсутність ГТФ і при його додаванні до піпеточного розчину у процесі десенситизації при повторних аплікаціях КХ.

Для визначення типу G-білка, що викликає пригнічення ICa при активації мускаринових рецепторів, використовувався коклюшний токсин, який селективно інактивує G-білки сімейств Gi/Go (Katada & Ui, 1982), роз'єднуючи їх зв'язок із рецептором. Коклюшний токсин блокував IКАТ і не впливав на амплітуду ICa у контролі, тобто у відсутності КХ (рис. 14). У 23 клітинах ICa у контрольній групі був  474±48 пА (n =11), а після обробки клітин токсином амплітуда ICa складала  384±55 пА (P>0, 2). Амплітуда IКАТ при аплікації КХ (50 М) у цих клітинах була  776±154 пА (n=11) і  29±12 пА, відповідно (P<0, 0001).

При аплікації КХ пригнічення ICa у клітинах, оброблених коклюшним токсином, було відсутнім або значно меншим (рис. 14). У контролі ефект складав 61, 9±10, 2% (n=11), а після обробки токсином – 8, 9±2, 2% (n=12) (P<0, 0001).

З метою порівняльної характеристики IКАТ вимірювався при підтримуваному потенціалі  50 мВ, при якому Ca2+ канали деактивовані, а ICa вимірювався під час коротких імпульсів до 0 мВ, що відповідає Erev IКАТ. У такий спосіб досягалося надійне розділення досліджуваних струмів.

Без фіксації рівня [Ca2+]i аплікація КХ викликала одночасно пригнічення ICa і генерацію IКАТ. Обидва ефекти за таких умов були двофазними. Початкова швидка фаза більшої амплітуди очевидно була обумовлена вивільненням Ca2+ із СР, що викликало Ca2+-залежну інактивацію Ca2+ каналів (Ganitkevich et al., 1987) і додаткову активацію катіонних каналів (Inoue & Isenberg, 1990). Крім того, таке початкове підвищення Ca2+ мало значення і для наступного стаціонарного пригнічення ICa. Так, у даних експериментах стаціонарне пригнічення при першій аплікації КХ складало 50±10% (n=5), тоді як при фіксації [Ca2+]i на рівні 100 нМ і при всіх інших рівних умовах ICa зменшувався на 27±4% (n=14) (P<0, 02).

Початкова фаза була відсутня в експериментах, у яких [Ca2+]i фіксувався на рівні 100 нМ із використанням 10 мМ BAPTA (рис. 14). Спостерігалося декілька істотних розходжень у кінетиці цих двох відповідей. По-перше, IКАТ досягав максимуму звичайно через 5-10 с, тоді як ICa продовжував зменшуватися протягом 1 хвилини. По-друге, у присутності КХ IКАТ десенситизувався (0 мМ ГТФ у піпетці), а ICa залишався на тому ж рівні. По-третє, після відмивання КХ IКАТ деактивувався протягом декількох секунд, тоді як відновлення ICa вимагало принаймні 2-3 хвилин. Це могло свідчити про участь різних G-білків або, за умови участі у відповіді того самого підтипу мускаринового рецептора і G білка, про істотні розходження у чутливості до активованих субодиниць G-білків. З метою з'ясування цих питань були проведені експерименти з повторними аплікаціями агоніста і порівняння ефектів без ГТФ і при додаванні 1 мМ ГТФ або ГДФS до піпеточного розчину. У присутності ГТФ обидва типа відповідей були стабільні у часі. Без додавання ГТФ спостерігалася швидка десенситизація IКАТ, але не пригнічення ICa. Результати експериментів з додаванням ГДФS теж співпадали з уявленнями про різницю у чутливості до активованих G-білків – генерація IКАТ повністю блокувалася при 1 мМ ГДФS, тоді як ефект пригнічення ICa зникав лише при 5 мМ ГДФS.

Оскільки тип мускаринового рецептора, що активує IКАТ, був визначений, задача його ідентифікації для ефекту КХ на ICa зводилася до порівняльного аналізу дії мускаринових антагоністів на IКАТ і ICa. У цих експериментах використовувалися М2 селективні антагоністи гімбацин і метоктрамін, а також М3 селективний антагоніст 4-DAMP. Порівняння ефектів для 10 досліджуваних клітин при паралельній реєстрації IКАТ і ICa дало практично ідентичні результати. Це дозволяло зробити висновок, що, як і у випадку активації IКАТ, пригнічення ICa викликається активацією М2 рецепторів. Цей висновок також цілком узгоджується з чутливістю обох відповідей до дії коклюшного токсину, оскільки цей токсин не впливає на G-білки, що активуються М3 рецепторами.

 

 

Ацетилхолін – це основний збуджуючий нейропередатчик, за участю якого здійснюється парасимпатичний контроль скорочувальної активності усіх вісцеральних і деяких судинних гладеньких м'язів. В останні роки інтерес до вивчення механізмів дії ацетилхоліну значно зріс, що обумовлено декількома причинами. З'ясувалося, що мускаринові рецептори належать до сімейства 7-ТМ рецепторів, які передають сигнал за участю G-білків. Це припускає можливість більш складних принципів регуляції у порівнянні з іонотропними рецепторами, де іонний канал є інтегральною частиною молекули рецептора. Крім того, мускаринові рецептори практично у всіх досліджених типах гладеньких м'язів виявилися гетерогенними, в основному представленими підтипами М2 і М3. У зв'язку з цим виникнула необхідність визначення функції кожного з підтипів рецептора. Ставало також очевидним, що холінергічна активація – це надзвичайно складний процес з одночасним залученням багатьох ефекторів (іонні