Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику

Предмет:

Тип роботи:

Автореферат

К-сть сторінок:

Мова:

Українська

Оцінка:

5-1 с, друга відповідь була значно більшою; при часі 3-6 с спостерігалося її повне пригнічення. Повне відновлення у середньому відбувалося за 60 с, але у кожній окремій клітині відновлення було по типу «усе або нічого» і могло бути більш швидким (10-20 с). Аналогічно цьому, після вивільнення InsP3 СВТ пригнічувалися, а потім поступово відновлялися, що свідчило про заповнення внутрішньоклітинних Ca2+ депо і можливість спонтанного вивільнення Ca2+ за участю ріанодинових рецепторів. Проте відповіді на InsP3 були відсутні набагато більш тривалий час, а їхнє відновлення знову таки відбувалося раптово і, як правило, за принципом “усе або нічого” (Рис. 4А). Результати цих експериментів вказують на важливу роль потенціалзалежного входу Са2+ через Са2+ канали L-типу у модуляції InsP3-індукованого вивільнення Са2+ і, таким чином, у виникненні осциляцій [Ca2+]i при холінергічному збудженні вісцеральних гладеньких м’язів. На користь цього свідчили і експерименти, в яких InsP3 вивільнявся у різні фази осциляцій IКАТ, що безпосередньо пов’язані з осциляціями [Ca2+]i. Так, на максимумі осциляції відповідь була відсутня (F1 і F3 на рис. 4Б), тоді як у проміжку між осциляціями відповідь звичайно була такої ж амплітуди, як і спонтанні осциляції (F2 і F4 на рис. 4Б).

Механізми холінергічної деполяризації ГМК

Загальна характеристика катіонного струму при активації мускаринових холінорецепторів

За фізіологічних умов холінергічна деполяризація супроводжується як входом Ca2+ ззовні, так і його вивільненням із СР. Виникаючі осциляції [Ca2+]i викликають осциляції IКАТ (рис. 4Б). Детальний біофізичний і фармакологічний аналіз властивостей IКАТ був можливий тільки при стаціонарних умовах. Таким чином, у подальших експериментах концентрація Ca2+ у клітині фіксувалася на рівні 100 нМ, що приблизно відповідає рівню у стані спокою, із використанням 10 мМ ВАРТА/4, 6 мМ CaCl2 у піпеточному розчині. Слід зазначити, що при використанні 10 мМ ВАРТА без додавання Ca2+, тобто в умовах неприродно низької концентрації Ca2+ у цитоплазмі клітини, як генерація IКАТ, так і пригнічення ICa цілком блокувалися. Таким чином, обидва механізми потребують деякого мінімального рівня Ca2+ у клітині.

Оскільки досліджувані канали не селективні для одновалентних катіонів, експерименти проводилися з використанням симетричних Cs+ розчинів (ECs=0 мВ) з метою блокування K+ струмів. Крім того, у більшості експериментів двовалентні катіони видалялися з зовнішнього розчину, щоб виключити їх вплив.

Карбахолін (КХ) збільшував амплітуду IКАТ відповідно до рівняння (1) з середніми параметрами: ЕC50=7, 8 *М, максимальна провідність Gmax=23, 3 нС, p=1, 4 (n=114). Гістограми розподілів цих параметрів добре описувалися кривими Гауса, що свідчило про відсутність різних популяцій клітин.

Значний інтерес являли собою потенціалзалежні релаксації IКАТ при раптових зміщеннях мембранного потенціалу, природа яких залишалася маловивченою (рис. 5). Релаксації струму описувалися одною експонентою з постійними часу для різних клітин від декількох десятків до декількох сот мілісекунд. У системі рецептор – G білок – іонний канал можуть виникати значно складніші взаємодії у порівнянні з більш простою ситуацією, коли іонний канал і місце зв'язування агоніста представлені однієї макромолекулою. Перша ланка в ланцюзі подій, що веде до відкривання каналу, тобто взаємодія агоніста і рецептора, у принципі могло б пояснити релаксації IКАТ за умови потенціалзалежності зв'язування агоніста. Проте таке припущення було малоймовірним, оскільки швидкості активації і деактивації струму при аплікації і відмиванні КХ були в 10-100 разів повільніші у порівнянні з його потенціалзалежними релаксаціями (рис. 5).

Потенціалзалежність IКАТ могла відображати властивості самого каналу, але навіть перші тести показали, що взаємодія агоніста з рецептором відіграє ключову роль. Так, кінетика релаксацій струму змінювалася в залежності від концентрації КХ і від часу після його додавання або видалення. Крім того, відбувалися істотні зміни у формі стаціонарної вольтамперної характеристики (рис. 6). При 3 *М струм при 120 мВ практично повністю деактивувався, тоді як при 300 *М вольтамперна залежність із U подібної перетворювалася у більш лінійну, а процес деактивації струму при 120 мВ дуже сповільнювався. Аналіз у термінах кривих активації катіонної провідності показав, що при підвищенні концентрації агоніста крива зміщувалася в область більш негативних потенціалів, а в процесі десенситизації при високої концентрації КХ вона поступово поверталася до свого вихідного положення на вісі потенціалів (рис. 6В). Величина V1/2 у середньому зміщалася на 36 мВ (варіації від 17 до 89 мВ) від 70±5 мВ до 106±5 мВ при підвищенні концентрації КХ від 3 до 300 М (n=16). При цьому нахил кривої не мінявся (k= 19, 3±0, 9 мВ). Відповідні зміни спостерігалися і у кінетиці релаксації струму під час скачку потенціалу до 120 мВ: величина  збільшувалася від 94±12 мс (3 *М КХ) до 178±14 мс (300 *М КХ), а потім поступово зменшувалася в процесі десенситизації до 112±13 мс (n=20).

Роль G-білків в активації катіонних каналів і в модуляції їх властивостей

Можна було припустити, що вплив концентрації КХ на швидкість і ступінь релаксації і на положення активаційної кривої опосередкований активацією G-білків. Концентрація активних G-білків визначається при всіх інших рівних умовах наявністю і концентрацією у клітині ГТФ, а їх активація ефективно блокується негідролізуємим аналогом ГДФ – ГДФS. Найбільше прямим тестом даної гіпотези було б додаткове активування або блокування G-білків при постійній концентрації КХ. При додаванні 1 мМ “caged” ГТФ до піпеточного розчину 3 спалахи