Негативна регуляція ініціації транскрипції на прикладі lac-оперона Escherichia coli

 

 

1. Відкриття lac -оперона E. coli

2. МУТАЦІЇ lac -ОПЕРОНА

3. КОМПЛЕМЕНТАЦІЙНІ ТЕСТИ З КОНСТИТУТИВНИМИ МУТАНТАМИ

4. lac мутації у цис-положенні

5. Lac- мутанти з домінантними мутаціями

6. Комплементаційні тести з конститутивними мутаціями

7. Цис-активні lacOс мутації

8. Транс – активні домінантні конститутивні мутації

9. Модель оперона Жакоба і Моно

10. Уточнення до Регуляції lac Оперона

11. Найбільш значні доробки

12. Регулювання Катаболізму lac Оперона

13. Структура lac Контролюючої Ділянки

14. Розташування lacІ мутації в Трьох-Вимірній Структурі LacI Репресора

15. Експериментальне використання lac -Оперона

 

 

За визначенням, системи негативної регуляції використовують репресор для припинення експресії генів. Репресор може перешкодити ініціації транскрипції кількома способами. Послідовність оператора може збігатися з послідовністю промотора, так що зв'язування репресора перешкоджає зв'язуванню РНК-полімерази на промоторі. Крім того, репресор може зігнути промотор ДНК таким чином, що РНК-полімераза не може зв'язатися. Репресор має також тримати РНК-полімеразу на промоторі так, щоб вона не могла покинути промотор і не може синтезувати РНК. Активність репресора може, в свою чергу, контролюватися фізіологічним сигналом, часто дрібними молекулами. Якщо сигнал активує репресор і припиняє експресію гена, то система є індуцибельною.

Негативні Індуцибельні системи

Негативні індуцибельні системи, в яких експресія регульованих генів вимкнена дією білка-репресора. Ефектор включає експресію гена (і, отже, є індуктором) шляхом інактивації репресора. Цей тип регуляторного механізму спільний для катаболічних оперонів, в яких часто індуктором для оперона є субстрат. Тому клітина потребує регульованих продуктів генів, які беруть участь в утилізації субстрату, тільки тоді, коли є субстрат. Негативні індуцибельні системи були першими охарактеризованими системами регулювання і служать як загальна парадигма регуляції генів. Яскравим прикладом є lac-оперон Escherichia coli.

 

 

Класичним прикладом негативної індуцибельної системи є lac -оперон Е. coli, який кодує ферменти, що забеспечують утилізацію цукру лактози. Експерименти Франсуа Жакоба, Жака Моно та їх співробітників на регуляцію lac генів кишкової палички є чудовим прикладом генетичного аналізу біологічного явища в бактерій. Хоча ці експерименти були проведені в кінці 1950-х років, невдовзі після відкриття структури ДНК та існування мРНК, вони до сих пір стоять в якості парадигми, з якими порівнюють всі інші дослідження регуляції експресії генів.

 

 

Коли Жакоб і Моно почали свою класичну працю, було відомо, що ферменти метаболізму лактози індуцибельні тому, що вони синтезуються тільки тоді, коли цукор лактоза присутній у середовищі. Якщо відсутня лактоза, ферменти не виробляються.

З точки зору клітини, це розумна стратегія, оскільки немає ніякого сенсу синтезувати ферменти для переробки лактози якщо її не можна використовувати як джерело Карбону й енергії. Щоб зрозуміти регуляцію lac-генів, Джакоб і Моно провели генетичний аналіз. По-перше, вони виділяють багато мутантів, у яких були порушення метаболізму лактози. Ці мутанти поділяються на дві принципово різні групи. Деякі мутанти були не в змозі рости у середовищі з лактозою в якості єдиного джерела живлення, і тому були названі Lacֿ мутантами. Інші мутанти синтезували ферменти метаболізму лактози незалежно від наявності чи присутності індуктора названі конститутивними мутантами. Звернули увагу на той факт, що було виділено багато конститутивних мутантів – це перший доказ того, що регуляція фактично негативна.

 

 

Як згадувалося вище, деякі lac мутації не роблять клітини з Lacֿ фенотипом, а, скоріше, їх конститутивними, так що вони експресують lacZ і lacY гени навіть у відсутність індуктора лактози. Щоб відповісти на ці питання, вони спочатку визначили чи lac мутація є домінантною чи рецесивною, який вимагає, щоб організми були диплоїдними, тобто з двома копіями гена що випробовуються.

Бактерії зазвичай гаплоїдні, з тільки однією копією кожного з генів, але «часткових диплоїдів» (далі меродиплоїди) для будь-яких генів одержуютьсяза введенням F' плазміди. Нагадаємо, що F'плазміда є плазмідою, у яку були вставлені деякі гени хромосом бактерій. Вони ввели F'плазміди як носії ділянки дикого типу в штам з lac мутацією в хромосомах (рис. 1).

Рис. 1. Комплементации двох рецесивних

lac мутацій. Одна мутація (m1) – в хромосомі, а інша (m2) F'плазміді. Якщо дві мутації комплементують одина одну клітини будуть Lac+ і буде рости з лактозу в якості єдиного джерела енергії та Карбону. Мутації не будуть комплементувати одина одну, якщо вони в тому ж гені або якщо одне впливає на регуляторний сайт або полярний

Якщо меродиплоїд бактерії Lac+ можуть розмножуватися і утворювати колонії на мінімальному середовищі з лактозою в якості єдиного джерела живлення, lac мутація є рецесивною. Якщо меродиплоїди Lac- і не можуть утворювати колонії на мінімальному середовищі з лактозою, lac мутація є домінантною. Жакоб і Моно виявили, що більшість lac мутацій рецесивні по відношенню до дикого типу і приблизно так інактивуються гени, продукти яких необхідні для засвоєння лактози.

Питання про те,