Негативна регуляція ініціації транскрипції на прикладі lac-оперона Escherichia coli

Поки ще значною мірою інтактно, модель оперона зазнала кілька уточнень протягом багатьох років. Як вже згадувалося вище, Жакоб і Моно не знали про існування гена lacA і думали, що lacY кодувала трансацетилазу, а не пермеазу, яка була невідома в той час. Крім того, більшість мутацій, що Жакоб і Моно визначили як lacр не були насправді мутаціями промотора, але замість цього були сильні полярні мутації в lacZ, що запобігає транскрипції всіх трьох структурних генів (lacZ, lacY, та lacA). Більш пізні дослідження також показали, що справжнім індуктором, який прив'язується до LacI репресора є алолактоза, метаболіт лактози, а не сама лактоза. У більшості експериментів, аналог алолактози називається ізопропіл- β – D – тіогалактопіранозид (IPTG) використовується в якості індуктора, тому що він не метаболізується клітинами.

 

 

Моделі оперона Жакоба і Моно прийшли з відкриттям, що LacI репресор може зв'язуватися з не однією, а з трьома операторами, що називаються o1, o2, та o3. (рис. 6).

   

 

Оператор o1 ближче до промотора, мабуть, найбільш важливий для припинення транскрипції lac експресії і діє стерично заважаючи зв'язуванню РНК-полімерази до промотора, оскільки послідовність зосереджена на позиції +11 від початкової точки транскрипції (+1) і, отже, збігається з позицією приєднання РНК-полімерази протягом ініціації транскрипції. Делеція або o2, або o3 має незначний вплив на репресію. Однак, видаливши обидві o2 та o3 зменшується репресію аж у 50 разів.

Чому lac оперон має більше одного оператора, тим більше, що ці оператори не так далеко від сайту зв'язування РНК-полімерази, що малоймовірно, що вони можуть блокувати зв'язування РНК-полімерази з промотором? Мета мати більше ніж один оператор для того, щоб LacI репресорна молекула могла зв'язати два оператори одночасно, згинаючи ДНК в області промотора між ними, щоб сформувати петлю ДНК. Це петлі ДНК стабілізує взаємодія LacI з ДНК. Як буде показано нижче, у багатьох інших оперонов, в тому числі gal і ara оперонов, також містять кілька операторів, які сприяють циклізації ДНК в промоторній області. У lac ситемах, формування петлі ДНК допомагає в репресії, але не потрібно для регулювання приєднання РНК- полімерази. Нові технології, в тому числі одномолекулярні дослідження, які дозволяють візуалізацію взаємодії між LacI і РНК-полімерази на індивідуальному матричному ланцюзі молекули ДНК, ймовірно, забезпечить нові проникливості в молекулярні механізми які лежать в основі регуляції транскрипції в цій системі.

 

12. Регулювання Катаболізму lac Оперона

 

На додаток до того, що під контролем власного специфічного репресора, lac -оперон регулюється у відповідь на наявність інших джерел Карбону шляхом катаболичной репресії. Катаболічні шляхи використовуються, щоб розщепити субстрати до продуктів у вигляді інших карбоновмісних сполук або енергії. У катаболічній репресії система гарантує, що гени для використання лактози не експресуватимуться якщо є доступним краще джерело Карбону й енергії, такі як глюкоза. Назва “катаболічна репресія» є неправильною, принаймні в E. coli, оскільки експресії оперонів під контролем катаболізму в E. coli вимагає транскрипційного активатора, катаболізм активуючого протеїну (CAP, історично звані Crp, для катаболізм репресорного протеїну), і низькомолекулярних ефекторів циклічних АМФ (cAMP). Багатьох оперонів під контролем CAP- cAMP – це тип глобального регулювання.

 

 

lac промотор являє собою типовий σ70 бактеріальний промотор з характерними -10 і -35 ділянками. Один з операторів, до якого приєднується LacI репресор (o1), перекриває початковий сайт транскрипції (+1) для транскрипції lacZ, lacY, та lacA.

Інші lac операторні послідовності розташовані по обидві сторони від промотора. Кожна симетрична половина оператора зв'язує мономер LacI. Одночасно прив'язка LacI тетрамера на двох сайтах оператора (наприклад, o1 і о3) дозволяє кожній з чотирьох субодиниць тетрамера, щоб взаємодіяти з половиною сайта оператора. CAP- зв'язуючий сайт, який збільшує зв'язування РНК-полімерази за відсутності глюкози, є трохи далі перед промотором.

 

 

Коли ген lacІ був секвенований, точні амінокислотні зміни в lac-репресора в результаті деякої мутації може бути визначено, в яких регіонах представлена інформація про LacI білки, які беруть участь у різних функціях репресора. Наприклад, lacIs мутації слід значною мірою обмежувати сайт білка, де приєднується індуктор, щоб ідентифіковати сайт. Крім того, lacI-d мутації не повинні інактивувати регіони, залучені до формування димера або тетрамера, оскільки мутантні білки повинні утворювати змішані димери або тетрамери з поліпептидом дикого типу, щоб був домінантним. Ми б очікували, що конститутивні lacI-d мутації будуть розкидані навколо білка, так як вони можуть вплинути на майже будь-яку активність білків, у тому числі його здатності зв'язуватися з ДНК та її здатності складатися в його кінцеву конформацію. Однак, з'ясувалося, що всі різні типи мутації часто розкидані по всьому гену і не завжди сконцентровані у певній ділянці. Багато років пізніше, коли з'явилася тривимірна структура білка, було легше щоб зрозуміти розподіл мутацій, оскільки амінокислоти, які не входять в лінійний поліпептид може бути близько один до одного в складеному білку.

LacI білок (рис. 7) кристалізували, і його тривимірна структура була визначена методом рентгенівської дифракції, також використовувалася ядерна магнітно-резонансна спектроскопія для визначення його взаємодії з lac операторами і як ця структура змінюється, коли приєднується індуктор IPTG.

 

 

Відстань між ДНК – зв'язуючими N – кінцевими доменами змінюється коли приєднується індуктор, запобігаючи її приєднання до оператора. Взаємодія, в ході якого індуктор зв'язується в одиній області білка і може сприяти змінам в іншій називається алостеричною. Деякі lacIs мутації також змінюють амінокислоти в алостеричному сигнальному регіоні, регіоні, який сигналізує до ДНК – зв'язуючих доменів, що зв'язаний індуктор в індуктор – зв'язуючій кишені. В цьому регіоні функціонує як домен димерізації, який допомагає тримати разом двох мономерів, а також змінює орієнтації двох мономерів що може бути частиною сигналу.

 

 

lac гени і регуляторні області знайшли багато застосувань в молекулярній генетиці. Наприклад, ген lacZ, напевно, найбільш широко використовується репортерний ген і був введений в широкий спектр різних організмів від бактерій до плодових мушок та до людських клітин. Він настільки популярний, тому що його продукт, β – галактозидаза, легко виявляється в колориметричному аналізі використовуючи субстрати, таких як X- Gal (5-бромо – 4 – хлоро – 3 – індоліл- β – D – галактопіранозид) і ONPG (о-нітрофеніл- β – D – галактопіранозид). Крім того, N – кінцевай частина білка є несуттєвою для діяльності, що полегшує синтез. Єдиний мінус lacZ як гена репортера полягає в тому, що його унікальний поліпептидний продукт дуже великий, що може бути недоліком в деяких видах системи експресії.

lac промотор або його похідні використовуються в багатьох векторах експресії. Цей промотор має багато переваг у цих векторів експресії. Вони досить сильні, що дозволяє високий рівень транскрипції клонованого гена. Він також є індуцибельним, що дає можливість для клонування генів, продукти яких є токсичними для клітин. В клітинах можуть бути вирощені за відсутності індуктора IPTG так що клонований ген не транскрибується. Коли клітини досягають високої щільності, доданий індуктор IPTG і клонований ген експресується. Навіть якщо білок є токсичним і вбиває клітини, коли синтезований в таких великих кількостях, достатньо білка зазвичай синтезується перед клітинною загибеллю.

Існує безліч похідних lac промотора у використанні. Ці похідні зберігають деякі з бажаних властивостей дикого типу lac промотора, але мають додаткові функції. Наприклад, мутований lac промотор lacUV5 – це

більше не чутливі до катаболичної репресії і так активно навіть якщо глюкоза присутня у середовищі. Гібрид trp-lac промотор (tac-промотор) також широко використовується. Перевагами tac-промотора є те, що він є сильнішим, ніж lac промотор і нечутливий до катаболитної репресії, але як і раніше зберігає свою індуцибельність за допомогою IPTG.

Тому що він приєднується дуже щільно до своєї операторної послідовності, LacI репресорний білок також має безліч застосувань. Один напрямок використання в бактерійній клітинній біології, щоб знайти певні ділянки ДНК у клітині. В одному із застосувань, LacI протеїн дифундує до зеленого флуоресцентного білока, який може бути виявлений в клітині шляхом флуоресцентної мікроскопії. Якщо фундуючий білок синтезується в

клітині, в якій кілька копій послідовності операторів були введені в області хромосоми, наприклад, поряд з послідовністю ініціації реплікації, то цей білок зв'язується в декількох екземплярах з регіоном ініціації реплікації хромосоми. Розташування регіону ініціації реплікації хромосоми можуть бути відстежені потім в клітині, як вона проходить через клітинний цикл шляхом спостереження флуоресценції синтезованого білка. Та ж система може бути експериментально використана для затримки реплікативної вилки ДНК, щоб аналізувати механізми хромосомної організації.

 

 

1. Molecular genetics of bacteria / Larry Snyder... [et al. ]. – 4th ed. p. ; cm. Rev. ed. of: Molecular genetics of bacteria / Larry Snyder and Wendy Champness. c2007.