Портал освітньо-інформаційних послуг «Студентська консультація»

  
Телефон +3 8(066) 185-39-18
Телефон +3 8(093) 202-63-01
 (066) 185-39-18
Вконтакте Студентська консультація
 portalstudcon@gmail.com
 facebook.com/studcons

<script>

  (function(i,s,o,g,r,a,m){i['GoogleAnalyticsObject']=r;i[r]=i[r]||function(){

  (i[r].q=i[r].q||[]).push(arguments)},i[r].l=1*new Date();a=s.createElement(o),

  m=s.getElementsByTagName(o)[0];a.async=1;a.src=g;m.parentNode.insertBefore(a,m)

  })(window,document,'script','//www.google-analytics.com/analytics.js','ga');

 

  ga('create', 'UA-53007750-1', 'auto');

  ga('send', 'pageview');

 

</script>

Принципова схема ідентифікації і кількісного визначення речовин, які ізолюються екстракцією полярними розчинниками

Предмет: 
Тип роботи: 
Лекція
К-сть сторінок: 
17
Мова: 
Українська
Оцінка: 
Тема: ПРИНЦИПОВА СХЕМА ІДЕНТИФІКАЦІЇ І  КІЛЬКІСНОГО ВИЗНАЧЕННЯ РЕЧОВИН,  ЯКІ ІЗОЛЮЮТЬСЯ ЕКСТРАКЦІЄЮ ПОЛЯРНИМИ РОЗЧИННИКАМИ
 
ПЛАН ЛЕКЦІЇ
 
1. Принципова схема аналізу «лікарських» отрут
2. ТСХ-скринінг «лікарських « отрут
3. Хімічні методи дослідження «лікарських» отрут
4. Фізико-хімічні методи ідентифікації препаратів
5. Фармакологічні дослідження «лікарських» отрут
6. Кількісне визначення «лікарських» отрут
 
1. Принципова схема аналізу «лікарських» отрут
 
Вибір схеми аналізу «лікарських» отрут залежить від ряду факторів:
Біологічного об'єкта дослідження (органи і тканини, біологічні рідини трупа, біологічні рідини живої людини) ;
Проведення спрямованого або неспрямованого азналізу препаратів;
Оснащення судово-хімічної або хіміко-токсикологічної лабораторії (апаратура, розчинники і реактиви).
Залежно від вищевказних факторів аналіз «лікарських» отрут проводиться в двох напрямках:
Судово-хімічне дослідження біологічного матеріалу, взятого з трупа (аналіз «лікарських» отрут в токсичних і летальних дозах -104 -106 г у пробі) ;
Хіміко-токсикологічне дослідження біологічних рідин живої людини (аналіз «лікарських» отрут у терапевтичних і токсичних дозах – 106 – 1012 г у пробі) ;
Вибір методів дослідження «лікарських» отрут залежить від напрямку аналізу, етапу і чутливості методики: 
Судово-хімічне дослідження біологічного матеріалу трупаЕтапиХіміко-токсикологічне дослідження біологічних рідин живої людини
Оцінка різних методів за чутливістю:
• Хімічні методи – 104-106 г у пробі.
• Фізико-хімічні методи – УФ-спектрометрія – 106-107 г у пробі, ТСХ – 106-107 г у пробі ГРХ – 108- 1010 г у пробі; ВЕРХ – 108- 1010 г у пробі;
• Імуннохімічні методи – 1010 -1012 г у пробі.
Схема ненаправленого дослідження
«лікарської» отрути в біологічному об'єкті
 
2. ТСХ-скринінг «лікарських» отрут
 
Процес ідентифікації невідомої лікарської сполуки, що стала причиною отруєння, складається з двох етапів: попереднього і підтверджуючого.
Попередній етап дозволяє віднести отруту до визначеної групи хімічних сполук і заснований на використанні методу тонкошарової хроматографії (ТСХ) і системи «скринінгу», тобто системи добору, просівання.
Вибір методу тонкошарової хроматографії для пошуку «лікарської» отрути при неспрямованому дослідженні зумовлений багатофункціональністю методу:
Поділ препаратів і їхніх метаболітів.
Очищення від домішок.
Ідентифікація групи або препаратів індивідуальної речовини.
Кількісна оцінка аналізованого препарату.
Попередній етап складається з двох стадій:
1 стадія – застосовуються загальні системи розчинників, що дозволяють розділити аналізовані речовини на групи, що локалізуються у визначених хроматографічних зонах. У випадку позитивного результату при використанні загальних систем розчинників приступають до другої стадії.
2 стадія – застосовуються окремі системи розчинників, що дозволяють ефективно розділити сполуки, що входять в ту чи іншу хроматографічну зону.
Підтверджуючий етап – після проведення двох стадій попереднього етапу проводять підтверджуючі дослідження, що включають комплекс хімічних, фізико-хімічних методів, а також фармакологічні проби.
Негативний результат попереднього дослідження навіть на першій стадії свідчить про відсутність токсичних доз лікарських препаратів в екстрактах з біологічного матеріалу.
Попереднє хроматографічне дослідження ефективне за умови аналізу біологічного матеріалу, який не піддався процесам гнильного розкладання.
Умови ТСХ-скринінгу речовин кислого і слабоосновного характеру:
Загальна система розчинників – ацетон-хлороформ (1: 9).
Хроматографічні пластини з закріпленим шаром силікагелю.
Довжина пробігу розчинників – 10 см.
Час насичення камери парами розчинника – 15-20 хв.
Хроматографічна пластина розділяється на 5 вертикальних смуг:
Стандарт По 1/25 „кислого” хлороформного екстракту – 1/10
Як стандарт використовується циклобарбітал. Після розвитку хроматограми і висушування пластини проводять проялення барбітуратів, похідних саліцилової кислоти, піразолону, алкалоїдів – похідних пурину, індолу, похідних 1, 4-бенздиазепіну.
Як проявники використовуються:
Для барбітуратів – послідовно 5% розчин HgSO4 і 0, 1% розчин дифенілкарбазону в хлороформі (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями – смуги S і А),
Для похідних саліцилової кислоти, піразолону – 5% або 10% розчин FeCl3 (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями – смуга Б),
Для алкалоїдів, похідних 1, 4-бенздиазепіну – реактив Драгендорфа по Муньє (спостерігаються оранжеві, оранжево-коричневі плями – смуга В).
Залежно від значень величин Rf сполуки на хроматограмі поділяють на три хроматографічні зони:
1. Зона з Rf – 0 -0, 25 – похідні піразолону, алкалоїди.
2. Зона з Rf – 0, 31- 0, 41 – барбітурати, похідні 1, 4-бенздиазепіну.
3. Зона з Rf – 0, 41- 0, 64 – похідні 1, 4-бенздиазепіну.
Rs – являє собою відношення величини Rf аналізуючої речовини до величини Rf стандарту (циклобарбіталу). Вибір стандарту здійснюють так, щоб величина RS знаходилася в межах – 0, 5-2. Величина Rs малочутлива до впливу випадкових відхилень в умовах експерименту і тому є більш точною оцінкою хроматографчної рухомості, ніж Rf.
Шар сорбенту з невиявленої смуги Г, розташований на одному рівні з забарвленою плямою на інших смугах з аналізованим екстрактом, знімають за допомогою скальпеля і елюють досліджувану речовину з:
• хроматографічної зони 1 – метанолом,
• хроматографічної зони 2 і 3 – ацетоном.
Елюат досліджують в окремих системах розчинників:
• Похідні піразолону, алкалоїди (I зона) – ацетон-циклогексан (5: 1), сорбент – основний окис алюмінію,
• Барбітурати, похідні 1, 4-бенздиаеепіну (2 зона) – хлороформ-бутанол-25% розчин аміаку (70: 40: 5), сорбент – силікагель КСК, забуферений розчином борної кислоти.
• Похідні 1, 4-бенздиазепіну (3 зона) – етилацетат-бензол-етанол-25% розчин аміаку (90: 15: 5: 2, 5), силікагель КСК.
Умови ТСХ-скринінгу речовин основного і слабоосновного характеру:
• Загальна система розчинників – хлороформ-диоксан-ацетон-25% розчин аміаку (45: 47, 5: 5: 2, 5) ;
• Хроматографічні пластини з закріпленим шаром силікагелю,
• Довжина пробігу розчинників – 10 см,
• Час насичення камери парами розчинника – 15-20 хв.
Хроматограф пластина розділяється на 5 вертикальних смуг
Стандарт По 1/25 „лужного” хлороформного екстракту – 1/10
Як стандарт використовується етаперазин. Після розвитку хроматограми і висушування пластини проводять проявлення алкалоїдів; похідних фенотіазину, 1, 4-бенздиазепіну, п-амінобензойної кислоти, піразолону.
Як проявники використовуються:
Для похідних фенотіазнну – 10% розчин Н2SO4 в етанолі (з'являються червоні і фіолетові плями – смуги S і А) ;
Для похідних фенотіазину, піразолону – 5% або 10% розчин FeCl3 (з'являються синьо-фіолетові або червоно-фіолетові плями -смуга Б) ;
Для алкалоїдів, похідних 1, 4-бенздиазепіну, п-амінобензойної кислоти – реактив Драгендорфа по Муньє (спостерігаються оранжеві, оранжево-коричневі плями – смуга В).
Залежно від значень величин Rf сполуки на хроматограмі поділяють на три хроматoграфичні зони:
1. Зона з Rf – 0, 12-0, 36 – алкалоїди;
2. Зона з Rf – 0, 50-0, 58 – пурини, похідні піразолону, фенотіазину;
3. Зона з Rf – 0, 63-0, 83 – похідні 1, 4-бенздиазепіну, фенотіазину, п-амінобензойної кислот;
4. Зона з Rf – 0, 6-0, 98 – алкалоїди, похідні 1, 4-бенздиазепіну, фенотіазину.
Шар сорбенту з невиявленої смуги Г, розташований на одному рівні з забарвленою плямою на інших смугах з аналізованим екстрактом, знімають за допомогою скальпеля і елюють досліджувану речовину з:
• хроматографічної зони 1 – сумішшю метанол-диетиламін (9: 1) ;
• хроматографічної зони 2 – 4 – сумішшю метанол-25% розчин аміаку (9: 1).
Елюат досліджують в окремих системах розчинників:
Алкалоїди (1 зона) – хлороформ-диетиламін (9: 1), сорбент – силікагель КСК;
Пурини, похідні піразолону, фенотіазину (2 зона) – хлороформ-етанол (5: 1), сорбент – нейтральний окис алюмінію;
Похідні 1, 4-бенздиазепіну, фенотіазину, п-амінобензойної кислот (3 зона) – хлороформ-етанол (20: 1), сорбент – основний окис алюмінію;
Алкалоїди, похідні 1, 4-бенздназепіну, фенотіазину (4 зона) – циклогексан-ацетон (5: 1), сорбент – основний окис алюмінію.
Результати попереднього хроматографічного дослідження підтверджуються хімічними і фізико-хімічними методами аналізу.
 
3. Хімічні методи дослідження «лікарських» отрут
 
Для виявлення «лікарських» отрут використовуються хімічні реакції – забарвлення, осадження і мікрокристалоскопічні.
Реакції забарвлення – в основі реакції забарвлення лежать наступні процеси:
Дегідратація (за допомогою Н2SO4 концентрованої) ;
Окислення препаратів (К2Сr2O7, в присутності Н2SO4 концентрованої),
Одночасне окислення і дегідратація.
Конденсації з альдегідами в присутності речовин, що поглинають воду.
Реакції забарвлення виконуються сухими й охолодженими осадами після видалення хлороформу. При проведенні реакцій забарвлення для лікарських отрут використовують наступні реактиви: концентровані кислоти (H2SO4, HNO3, HCl) ; реактиви Марки (H2SO4 конц. і формальдегід) ; Фреде (H2SO4 конц. і молібдат амонію) ; Ердмана (H2SO4 конц. і HNO3 конц.) ; Манделіна (H2SO4 конц. і ванадат амонію).
Оцінка результатів реакцій забарвлення:
Можливість виключення окремих лікарських отрут і їхніх груп, що дозволяє вибрати раціональну схему аналізу хлороформної витяжки,
Можливість знайти наявність окремих отрут і навіть груп отрут (реактив Марки орієнтує на пошук алкалоїдів похідних ізохіноліну) ;
Недоліком реакцій забарвлення є неспецифічність, невисока чутливість, нестійкість отриманого забарвлення, що може змінюватися під впливом окислювачів повітря і світла або зникати;
Головною умовою проведення реакцій забарвлення є високий ступінь чистоти хлороформних витяжок, тому що залишки білка під дією сульфатної кислоти обвуглюються, азотної – окислюються, що маскує основний результат.
Реакції осадження – в основі реакції осадження лежать наступні процеси:
Утворення солей погано розчинних у водному середовищі (при взаємодії алкалоїдів з фосфорномолібденовою кислотою – реактив Зонненшейна, з фосфорновольфрамовою кислотою – реактив Шейдлера, пікриновою кислотою, дубильною кислотою – таніном і ін},
Утворення комплексів з важкими металами погано розчинних у водному середовищі (при взаємодії алкалоїдів з реактивами Драгендорфа, Марме, Майєра).
Оцінка результатів реакцій осадження:
Всі реактиви групового осадження з алкалоїдами, їхніми синтетичними аналогами й іншими органічними речовинами основного характеру дають аморфні осади,
Перевагами реакцій осадження з загальноалкалоїдними реактивами є їхня висока чутливість (найбільшою чутливістю характеризуються фосфорномолібденова і фосфорновольфрамова кислоти і реактив Драгендорфа, найменшої – танін) ;
Недоліком реакцій осадження є неспецифічність, тому що білки можуть давати аналогічні осади. Хіміко-токсикологічне значення реакцій осадження з реактивами групового осадження алкалоїдів має негативний результат.
Мікрокристалоскопічні реакції – засновані на осадженні досліджуваних речовин за допомогою відповідних реактивів і на визначенні форми кристалів, що утворюються.
Оцінка результатів реакцій осадження:
Трудністю є те, що форма кристалів, які утворюються, залежить від багатьох факторів, до числа яких відносяться концентрація досліджуваної речовини, концентрація реактиву, співвідношення об’ємів розчинів досліджуваної речовини і реактиву, температура, рН середовища, наявність домішок, поліморфізм кристалів, що утворюються і ін.,
Реакції високо чутливі і специфічні при умовах лабораторії, в якій проводяться дослідження.
 
4. Фізико-хімічні методи ідентифікації препаратів
 
В хіміко-токсикологічному аналізі лікарських отрут переважно використовуються спектральні методи (спектроскопія в УФ – і ІЧ-областях) і хроматографічні методи (ТСХ, ГРХ, ВЕРХ, електрофорез).
Спектральні методи аналізу:
Спектри поглинання у видимій і ультрафіолетовій області, зв'язані з електронними переходами, одержали назву електронних спектрів.
Область електронних переходів охоплює інтервал спектру електромагнітних хвиль від 100 до 800 нм (106 – 104 см). Ця область підрозділяється на: видиму – з інтервалом довжин хвиль від 400 до 800 нм, і ультрафіолетову – з діапазоном від 100 до 400 нм. Остання також поділяється на: ближню – від 200 до 400 нм, і дальню (вакуумну) – від 100 до 200 нм.
Електрони, що входять до складу атомів і молекул, розрізняються по своєму енергетичному стану (1s-, 2s-, 2р-електрони й ін). Для їхнього збудження потрібно випромінювання з різною довжиною хвилі (енергією). Найбільша енергія необхідна для збудження електронів простого С-С-зв'язку (σ-електрони). Трохи менша енергія потрібня для збудження електронів інших простих зв'язків, наприклад атома вуглецю з атомом, що містить неподілену пару електронів (π-електрони). Молекули органічних речовин, які не містять парних зв'язків, не мають характерного поглинання в робочій зоні в УФ-області (200-400 нм). Групи атомів, що містять одну або кілька кратних зв'язків, називають хромофорами, вони викликають вибіркове поглинання електромагнітного випромінювання в УФ-області. Якщо ж є зв'язок (сполучення) хромофорів один з одним або з π-електронними системами – ауксохромами (ОН, NH3, СН4 і ін), то максимум поглинання речовини зміщується в довгохвильову область (батохромне зрушення).
Максимуми поглинання деяких хромофорів:
Вплив замісників на положення смуг поглинання монозаміщених похідних бензолу (в етанолі) :
Морфін 284 нм (Е1сν 1% = 194) 296 нм (Е1сν 1% = 274)
Молекули сполук останньої групи містять хромофори, сполучені з ауксохромами і можуть мати всі види електронних переходів. В результаті іонізації молекули при зміні рН розчинів смуги поглинання зміщуються в довгохвильову частину спектра (батохромне зрушення) або короткохвильову область (гіпсохромне зрушення). Деякі речовини (барбітурати), що не мають характерного поглинання в кислому середовищі в області робочої зони (200 – 400 нм), при підлужувані починають поглинати в зв'язку з появою хромоформного угруповання.
Речовини, що відносяться до групи сполук, що мають вибіркове поглинання в Уф-області, яке залежить від рН-середовища, представляють найбільш цікаве коло об'єктів дослідження в хіміко-токсикологічному аналізі.
Метод УФ-спектрометрії чутливий, цікавий для проведення кількісного визначення, досить точний, але вимагає ретельного очищення аналізованих речовин від супутніх домішок, що не завжди вдається при хіміко-токсикологічному дослідженні об'єктів біологічного походження.
Метод ІЧ-спектроскопії менш чутливий, ніж УФ-спектрометрії, спектри більш складні для розшифрування, тому при хіміко-токсикологічних дослідженнях використовуються недостатньо широко.
При проведенні хіміко-токсикологічних досліджень спектральний аналіз звичайно проводиться після хроматографічного скринінгу і є спрямованим. Він включає очищення виділеної сполуки і зняття спектрів, найчастіше в УФ-області при різних значеннях рН розчину й у різних розчинниках (при необхідності).
Очищення проводиться головним чином за допомогою хроматографії в тонкому шарі сорбенту, у випадках речовин кислотно-основного характеру – екстракційним методом або сполученням двох видів очищення.
Хроматографічні методи:
Умови газохроматографічного аналізу «лікарських отрут»:
Газовий хроматограф ЛХМ-80 з термоаерозольним детектором (ТАД) чи Perkin – Elmer F-22 з безполум’яним азотно-фосфорним детектором (NPD). Колонка скляна, силанізована, довжиною 1 м, внутрішній діаметр 2-3 мм. Сорбент – 3% -ний SE-30 на хромосорбі W (НР) -80 – 100 меш. Швидкість газу-носія – 45 мл/хв азоту для ТАД і 40 мл/хв гелію для NPD. Ефективність хроматографічних колонок по додекану при 100°С для ТАД і NPD відповідно 1200 т. т і 1350 т. т. Селективність детектування оптимзована по кофеїну і гексадекану. При цьому встановлені наступні витрати допоміжних газів: для ТАД – 18 мл/хв водню, 200 мл/хв повітря, 135 мл/хв азоту через генератор аерозолю з хлоридом рубідію при температурі генератора 5100С; для NPD з кулькою силікату рубідію – 1 мл/хв водню і 60 мл/хв повітря. Температура детектора 300°С. Температура випаровувача 250°С. Температура термостату колонки змінюється по лінійній програмі від 130 до 290°С зі швидкістю 20°С в хвилину. Витримування при кінцевій температурі займає до 15 хвилин загального часу аналізу. Об’єм проби, що вводиться – 2, 5 мкл.
Умови поділу «лікарських отрут» методом високоефективної рідинної хроматографії на прикладі 1, 4-бензодиазепінів:
  • хроматографічна колонка (62x2 мм), заповнена зворотньо-фазним сорбентом «Сепарон» С18 (5 мкм) (колонка подається з хроматографом).
  • як рухливу фазу (елюент) для поділу нативних бензодиазепінів (крім медазепаму) використовують суміш 0, 05 М водного розчину двухзаміщеного фосфату амонію й ацетонітрилу (65: 35) – рН=7, 8;
  • детектування нативних 1, 4-бензодиазепінів проводиться при довжині хвилі 230 нм;
  • у якості елюенту для поділу продуктів гідролітичного розщеплення нативних бензодиазепінів – бензофенонів (і медазепаму) використовується система тих же розчинників, але в співвідношенні 45: 55;
  • детектування бензофенонів проводиться при довжині хвилі 220 нм;
  • швидкість потоку елююровання – 100 мкл/хв.
Ідентифікація «лікарських» отрут методами ГРХ і ВЕРХ проводиться за параметрами утримання піків.
 
5. Фармакологічні дослідження «лікарських» отрут
 
Деякі отруйні речовини при дії на організм тварин викликають характерні фізіологічні реакції. Так, наприклад, атропін, введений в око кішки, викликає розширення зіниці. Після нанесення розчину нікотину на спинку жаби вона приймає характерну позу. Те ж стосується і стрихніну. При нанесенні його на спинку жаби з'являються титанічні судороги, а потім жаба приймає позу, характерну для дії стрихніну.
Фармакологічні іспити отруйних речовин, виділених з біологічного матеріалу і добре очищених за допомогою відповідних методів, повинні виконувати фахівці – фармакологи, що мають спеціальні пізнання в цій області і які володіють технікою експерименту.
 
6. Кількісне визначення «лікарських» отрут
 
Кількісне визначення токсичних речовин, виділених з біологічного матеріалу, є заключним етапом хіміко-токсикологічного аналізу. Кількісне визначення токсичних речовин виробляється після їхньої ідентифікації. При ідентифікації можуть бути виявлені токсичні речовини, що прийняті померлим перед смертю в терапевтичних дозах (з лікувальною метою) і не були причиною отруєння. Дозу отрути, що поступила в організм, можна оцінити тільки на підставі результатів кількісного визначення.
В хіміко-токсикологічному аналізі для кількісного визначення токсичних речовин, виділених з біологічного матеріалу й інших об'єктів, застосовуються чутливі фотоколориметричні, спектрофотометричні, газохроматографічні і деякі інші методи. Через малу чутливість гравіметричних і титриметричних методів вони практично не застосовуються в хіміко-токсикологічному аналізі. Виділені з біологічного матеріалу речовини, що піддаються кількісному визначенню, повинні бути добре очищені від білкових сполук, продуктів їхнього розкладання, які утворюються в трупному матеріалі, і від інших домішок.
Незважаючи на велике значення результатів кількісного визначення отруйних речовин, виділених з біологічного матеріалу, для розв’язку питання про отруєння в ряді випадків результати цих визначень можуть бути занижені. Це пояснюється рядом причин.
Токсичні речовини в організмі деякою мірою піддаються метаболізму. Речовини, що викликали отруєння, нерівномірно розподіляються в органах і тканинах організму. В одних органах ці речовини знаходяться в великих кількостях, ніж в інших, а в деяких органах і тканинах ці речовини можуть бути відсутні. Тому результати хіміко-токсикологічного аналізу залежать від правильного вибору органів і тканин, які направляються на дослідження. Отруйні речовини в організмі зв'язуються з білковими й іншими сполуками. Кількість речовин, які виділяються і які переходять у витяжки з біологічного матеріалу, залежить від застосовуваного методу виділення токсичних речовин з відповідних об'єктів. Кількість токсичних речовин, виділених з біологічного матеріалу, залежить і від ступеня гнильного розкладання досліджуваних об'єктів. Вплив зазначених вище факторів на виділення токсичних речовин необхідно враховувати при оцінці результатів кількісного визначення отрут, виділених з біологічного матеріалу в ході хіміко-токсикологічного аналізу.
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Фото Капча