Принципова схема ідентифікації і кількісного визначення речовин, які ізолюються екстракцією полярними розчинниками

 

 

В хіміко-токсикологічному аналізі лікарських отрут переважно використовуються спектральні методи (спектроскопія в УФ – і ІЧ-областях) і хроматографічні методи (ТСХ, ГРХ, ВЕРХ, електрофорез).

Спектральні методи аналізу:

Спектри поглинання у видимій і ультрафіолетовій області, зв'язані з електронними переходами, одержали назву електронних спектрів.

Область електронних переходів охоплює інтервал спектру електромагнітних хвиль від 100 до 800 нм (106 – 104 см). Ця область підрозділяється на: видиму – з інтервалом довжин хвиль від 400 до 800 нм, і ультрафіолетову – з діапазоном від 100 до 400 нм. Остання також поділяється на: ближню – від 200 до 400 нм, і дальню (вакуумну) – від 100 до 200 нм.

Електрони, що входять до складу атомів і молекул, розрізняються по своєму енергетичному стану (1s-, 2s-, 2р-електрони й ін). Для їхнього збудження потрібно випромінювання з різною довжиною хвилі (енергією). Найбільша енергія необхідна для збудження електронів простого С-С-зв'язку (σ-електрони). Трохи менша енергія потрібня для збудження електронів інших простих зв'язків, наприклад атома вуглецю з атомом, що містить неподілену пару електронів (π-електрони). Молекули органічних речовин, які не містять парних зв'язків, не мають характерного поглинання в робочій зоні в УФ-області (200-400 нм). Групи атомів, що містять одну або кілька кратних зв'язків, називають хромофорами, вони викликають вибіркове поглинання електромагнітного випромінювання в УФ-області. Якщо ж є зв'язок (сполучення) хромофорів один з одним або з π-електронними системами – ауксохромами (ОН, NH3, СН4 і ін), то максимум поглинання речовини зміщується в довгохвильову область (батохромне зрушення).

Максимуми поглинання деяких хромофорів:

Вплив замісників на положення смуг поглинання монозаміщених похідних бензолу (в етанолі) :

Морфін 284 нм (Е1сν 1% = 194) 296 нм (Е1сν 1% = 274)

Молекули сполук останньої групи містять хромофори, сполучені з ауксохромами і можуть мати всі види електронних переходів. В результаті іонізації молекули при зміні рН розчинів смуги поглинання зміщуються в довгохвильову частину спектра (батохромне зрушення) або короткохвильову область (гіпсохромне зрушення). Деякі речовини (барбітурати), що не мають характерного поглинання в кислому середовищі в області робочої зони (200 – 400 нм), при підлужувані починають поглинати в зв'язку з появою хромоформного угруповання.

Речовини, що відносяться до групи сполук, що мають вибіркове поглинання в Уф-області, яке залежить від рН-середовища, представляють найбільш цікаве коло об'єктів дослідження в хіміко-токсикологічному аналізі.

Метод УФ-спектрометрії чутливий, цікавий для проведення кількісного визначення, досить точний, але вимагає ретельного очищення аналізованих речовин від супутніх домішок, що не завжди вдається при хіміко-токсикологічному дослідженні об'єктів біологічного походження.

Метод ІЧ-спектроскопії менш чутливий, ніж УФ-спектрометрії, спектри більш складні для розшифрування, тому при хіміко-токсикологічних дослідженнях використовуються недостатньо широко.

При проведенні хіміко-токсикологічних досліджень спектральний аналіз звичайно проводиться після хроматографічного скринінгу і є спрямованим. Він включає очищення виділеної сполуки і зняття спектрів, найчастіше в УФ-області при різних значеннях рН розчину й у різних розчинниках (при необхідності).

Очищення проводиться головним чином за допомогою хроматографії в тонкому шарі сорбенту, у випадках речовин кислотно-основного характеру – екстракційним методом або сполученням двох видів очищення.

Хроматографічні методи:

Умови газохроматографічного аналізу «лікарських отрут»:

Газовий хроматограф ЛХМ-80 з термоаерозольним детектором (ТАД) чи Perkin – Elmer F-22 з безполум’яним азотно-фосфорним детектором (NPD). Колонка скляна, силанізована, довжиною 1 м, внутрішній діаметр 2-3 мм. Сорбент – 3% -ний SE-30 на хромосорбі W (НР) -80 – 100 меш. Швидкість газу-носія – 45 мл/хв азоту для ТАД і 40 мл/хв гелію для NPD. Ефективність хроматографічних колонок по додекану при 100°С для ТАД і NPD відповідно 1200 т. т і 1350 т. т. Селективність детектування оптимзована по кофеїну і гексадекану. При цьому встановлені наступні витрати допоміжних газів: для ТАД – 18 мл/хв водню, 200 мл/хв повітря, 135 мл/хв азоту через генератор аерозолю з хлоридом рубідію при температурі генератора 5100С; для NPD з кулькою силікату рубідію – 1 мл/хв водню і 60 мл/хв повітря. Температура детектора 300°С. Температура випаровувача 250°С. Температура термостату колонки змінюється по лінійній програмі від 130 до 290°С зі швидкістю 20°С в хвилину. Витримування при кінцевій температурі займає до 15 хвилин загального часу аналізу. Об’єм проби, що вводиться – 2, 5 мкл.

Умови поділу «лікарських отрут» методом високоефективної рідинної хроматографії на прикладі 1, 4-бензодиазепінів:

• хроматографічна колонка (62x2 мм), заповнена зворотньо-фазним сорбентом «Сепарон» С18 (5 мкм) (колонка подається з хроматографом).
• як рухливу фазу (елюент) для поділу нативних бензодиазепінів (крім медазепаму) використовують суміш 0, 05 М водного розчину двухзаміщеного фосфату амонію й ацетонітрилу (65: 35) – рН=7, 8;
• детектування нативних 1, 4-бензодиазепінів проводиться при довжині хвилі 230 нм;
• у якості елюенту для поділу продуктів гідролітичного розщеплення нативних бензодиазепінів – бензофенонів (і медазепаму) використовується система тих же розчинників, але в співвідношенні 45: 55;
• детектування бензофенонів проводиться при довжині хвилі 220 нм;
• швидкість потоку елююровання – 100 мкл/хв.

Ідентифікація «лікарських» отрут методами ГРХ і ВЕРХ проводиться за параметрами утримання піків.

 

 

Деякі отруйні речовини при дії на організм тварин викликають характерні фізіологічні реакції. Так, наприклад, атропін, введений в око кішки, викликає розширення зіниці. Після нанесення розчину нікотину на спинку жаби вона приймає характерну позу. Те ж стосується і стрихніну. При нанесенні його на спинку жаби з'являються титанічні судороги, а потім жаба приймає позу, характерну для дії стрихніну.

Фармакологічні іспити отруйних речовин, виділених з біологічного матеріалу і добре очищених за допомогою відповідних методів, повинні виконувати фахівці – фармакологи, що мають спеціальні пізнання в цій області і які володіють технікою експерименту.

 

 

Кількісне визначення токсичних речовин, виділених з біологічного матеріалу, є заключним етапом хіміко-токсикологічного аналізу. Кількісне визначення токсичних речовин виробляється після їхньої ідентифікації. При ідентифікації можуть бути виявлені токсичні речовини, що прийняті померлим перед смертю в терапевтичних дозах (з лікувальною метою) і не були причиною отруєння. Дозу отрути, що поступила в організм, можна оцінити тільки на підставі результатів кількісного визначення.

В хіміко-токсикологічному аналізі для кількісного визначення токсичних речовин, виділених з біологічного матеріалу й інших об'єктів, застосовуються чутливі фотоколориметричні, спектрофотометричні, газохроматографічні і деякі інші методи. Через малу чутливість гравіметричних і титриметричних методів вони практично не застосовуються в хіміко-токсикологічному аналізі. Виділені з біологічного матеріалу речовини, що піддаються кількісному визначенню, повинні бути добре очищені від білкових сполук, продуктів їхнього розкладання, які утворюються в трупному матеріалі, і від інших домішок.

Незважаючи на велике значення результатів кількісного визначення отруйних речовин, виділених з біологічного матеріалу, для розв’язку питання про отруєння в ряді випадків результати цих визначень можуть бути занижені. Це пояснюється рядом причин.

Токсичні речовини в організмі деякою мірою піддаються метаболізму. Речовини, що викликали отруєння, нерівномірно розподіляються в органах і тканинах організму. В одних органах ці речовини знаходяться в великих кількостях, ніж в інших, а в деяких органах і тканинах ці речовини можуть бути відсутні. Тому результати хіміко-токсикологічного аналізу залежать від правильного вибору органів і тканин, які направляються на дослідження. Отруйні речовини в організмі зв'язуються з білковими й іншими сполуками. Кількість речовин, які виділяються і які переходять у витяжки з біологічного матеріалу, залежить від застосовуваного методу виділення токсичних речовин з відповідних об'єктів. Кількість токсичних речовин, виділених з біологічного матеріалу, залежить і від ступеня гнильного розкладання досліджуваних об'єктів. Вплив зазначених вище факторів на виділення токсичних речовин необхідно враховувати при оцінці результатів кількісного визначення отрут, виділених з біологічного матеріалу в ході хіміко-токсикологічного аналізу.