Дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції

Особистий внесок автора в отримання наукових результатів. Особисто автором зроблений огляд літератури по даній проблемі. Досліджено АТФазну активність латротоксинподібного білка. Досліджено вплив латротоксинподібного білка на роботу кальцієвих каналів P- та L-типів свіжоізольованих нейронів Пуркіньє мозочка та нейронів гіпокампа, відповідно. Дослідження впливу латротоксинподібного білка на генерування спонтанних постсинаптичних відповідей на культурі нейронів гіпокампа проведено спільно зі старшим науковим співробітником Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця – к. б. н. Сторожуком М. В. Дослідження здатності латротоксинподібного білка впливати на процес АТФ – індукованого злиття біологічних мембран та дослідження здатності латротоксинподібного білка впливати на процес злиття штучних мембран в нативному стані та при дії ендогенних та екзогенних модуляторних факторів гіпокампа проведено спільно зі старшими науковими співробітниками Інститута фізіології ім. О. О. Богомольця – к. б. н. Колчинською Л. І. і к. б. н. Кастрикіною Т. Ф. та старшими науковими співробітниками Інститута біохімії ім. О. В. Палладіна – к. б. н. Терлецькою Я. Т. і к. б. н. Трікаш І. О. Проведена обробка та статистичний аналіз усіх результатів.

Апробація результатів дисертації: на Міжнародному симпозіумі в Київі (Україна) (1997), Дев‘ятому міжнародному конгресі в Нешвілі (США) (1997), на інститутських наукових семінарах та семінарах Сектору молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Публікації. Результати досліджень опубліковані в 4 наукових статтях та 3 тезах конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень, обговорення, висновків та списку використаних джерел із 233 найменувань. Робота викладена на 153 сторінках та ілюстрована 28 рисунками.

 

 

Об’єкт досліджень. Дослідження здатності латротоксинподібного білка викликати злиття мембранних структур проводили з використанням модельних систем, що містили синаптичні мембрани і везикули; лише синаптичні везикули; або систему ліпосом. Дослідження впливу латротоксинподібного білка на кальцієві канали проводили на свіжоізольованих нейронах гіпокампа та нейронах Пуркіньє мозочка. Дослідження здатності латротоксинподібного білка впливати на спонтанну синаптичну активність проводили з використанням культури клітин гіпокампа.

Метод виділення латротоксинподібного білка. Латротоксинподібний білок виділяли із сірої речовини головного мозку бика з використанням іонообмінної та гідрофобної хроматографій, за методом {Трикаш И. О., Терлецкая Я. Т., et al. 1998}.

Дослідження злиття ліпосом та біологічних мембран. Злиття ліпосом реєстрували по зміненню інтенсивності флюоресценції за рахунок утворення комплексу Tb3+-ДПК внаслідок злиття мембран двох типів ліпосом 1-ий з яких містив TbCl3 і 2-ий – ДПК. Як контролі використовували: на мінімальний рівень флюоресценції (0%) – типову реакційну суміш без додавання білка, на максимальний рівень флюоресценції (100%) – ліпосоми що містили TbCl3 і ДПК. Злиття біологічних мембран досліджували за допомогою флуоресцентного барвника 18. Як контролі використовували: на мінімальний рівень флюоресценції (0%) – типову реакційну суміш без вмісту білку, на максимальний рівень флюоресценції (100%) -отриману суміш, після додавання до досліджуваної суспензії октаетиленглікольдодецилефіру в кінцевій концентрації 0, 25%. Вимірювання проводили на флюоресцентному спектрофотометрі Хітачі 650-10 в умовах збудження 276 нм і емісії 545 нм з використанням відсікаючого фільтру 530 нм для усування світлорозсіювання.

Визначення АТФ-азної активності латротоксинподібного білка. Визначення АТФ-азної активності проводили при 37С в 2 мл. реакційної суміші такого складу (в мМ) : АТФ-1; Трис-НСІ-10 (pH 7. 0, або рН 8, 1) ; MgCl2-1; 50-100 мкг білку. Кількість утвореного неорганічного фосфату вимірювали за допомогою методу {P. S. Chen et. al. 1956}. Як контроль на реактиви використовували відповідну аліквоту реакційної суміши з додаванням білка безпосередньо перед фарбуванням.

Методика отримання поодиноких ізольованих нейронів гіпокампа та Пуркін’є мозочока. Для отримання ізольованих нейронів застосовувався метод м'якої ферментативної обробки. Для експериментів використовували щурів лінії Вістар, віком 13 (для мозочка) та 17 діб (для гіпокампа). Ферментативну обробку проводили на протязі 35-40 хв з додаванням протеази (Sigma, P-5147, from Aspergillus oryzae) 8-9 мг та 12 мг на 5мл, відповідно для гіпокампа та мозочка при t-32? C. При електрофізіологічному дослідженні нейрони зберігали стабільність характеристик електрозбудливих іонних струмів та були здатні відповідати на аплікацію сполук протягом 30-90 хвилин.

Методика отримання культури клітин гіпокампу. Для приготування первинної культури нейронів гіпокампа використовували мозок новонародженних щурів лінії Вістар. Зрізи гіпокампа товщиною 200-300 мкм оброблялися ферментативно розчином 0. 05% пронази Е (Sigma) протягом 18 хвилин при 32С. Для підтримання життєдіяльності клітин використовували мінімальне середовище Ігла (МЕМ, “Sigma”, США) з додаванням 10% кінської сироватки (Gibco, США). Дослідження проводили в культурі віком від 14 до 25 діб.

Електрофізіологічні вимірювання. Для реєстраціі іонних струмів крізь мембрану нейронів був застосований метод внутриклітинноі перфузіі (Неер Э., Сакман Б. (1992)). Внутришньопіпетковий розчин містив (в мМ) : 70