Портал освітньо-інформаційних послуг «Студентська консультація»

  
Телефон +3 8(066) 185-39-18
Телефон +3 8(093) 202-63-01
 (093) 202-63-01
 studscon@gmail.com
 facebook.com/studcons

<script>

  (function(i,s,o,g,r,a,m){i['GoogleAnalyticsObject']=r;i[r]=i[r]||function(){

  (i[r].q=i[r].q||[]).push(arguments)},i[r].l=1*new Date();a=s.createElement(o),

  m=s.getElementsByTagName(o)[0];a.async=1;a.src=g;m.parentNode.insertBefore(a,m)

  })(window,document,'script','//www.google-analytics.com/analytics.js','ga');

 

  ga('create', 'UA-53007750-1', 'auto');

  ga('send', 'pageview');

 

</script>

Дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції

Предмет: 
Тип роботи: 
Автореферат
К-сть сторінок: 
27
Мова: 
Українська
Оцінка: 

рН 6, 0 додавання латротоксинподібного білка до інкубаційного середовища призводило до того, що вже на самому початку інкубації відносна кількість ліпосом, що злилися, становила близько 35%.

Вплив фосфорилювання латротоксинподібного білка на його здатність викликати злиття негативно заряджених ліпосом. Фосфорилювання білків може призводити до значних змін їх функціональних властивостей, і, відповідно, було цікавим з’ясувати, чи призведе фосфорилювання латротоксинподібного білка до модифікації його фузогенної активності. Фосфорилювання латротоксинподібного білка проводили з використанням каталітичної субодиниці цАМФ-залежної протеїнкінази за стандартною методикою. Нами було показано, що за умов фізіологічного рН фосфорилювання латротоксинподібного білка призводить до значного зниження його здатності викликати злиття негативно заряджених ліпосом (рис. 6). Додавання нефосфорильованого латротоксинподібного білка до інкубаційного середовища призводило до лінійного збільшення відносного проценту мембран, що злилися, і після 6 хвилин інкубації швидкість цього процесу не зменшувалась. Злиття ліпосом під дією нативного латротоксинподібного білка приймали за контроль. Ефективність впливу фосфорильованого латротоксинподібного білка знижувалась майже на 65%. При зсуві рН в бік кислого середовища (рис. 7) фосфорилювання білка додатково збільшувало його здатність викликати злиття негативно заряджених ліпосом. За цих умов ефективність дії латротоксинподібного білка зростала майже на 43 відсотки, в порівнянні з контролем. В обох випадках наростання кількості ліпосом, що злилися, мало лінійну залежність. Таким чином, отримані нами результати дали нам змогу припустити, що латротоксинподібний білок здатен змінювати свою активність під впливом різних факторів, що опосередковують модуляцію активності інших білків, зокрема білків синаптичної передачі в умовах in vivo.
Вплив N-етилмалієміду на здатність латротоксинподібного білка викликати злиття негативно заряджених ліпосом. З літературних даних відомо, що білки родини ААА-АТФаз, що опосередковують злиття мембран, дуже чутливі до впливу N-етилмалієміду. Дослідження впливу N-етилмалієміду на активність латротоксинподібного білка проводили з використанням системи ліпосом. Латротоксинподібний білок попередньо обробляли розчином N-етилмалієміду. Наши дослідження показали, що за таких умов фузогенна активність латротоксинподібного білка значно знижується (рис. 8), але не зникає зовсім. Варто відмітити, що в обох випадках математично процес злиття ліпосом під дією обробленого N-етилмаліємідом та нативного латротоксинподібного білка описувався одноекспоненційними кривими з постійною часу наростання τ=3, 6 ± 0, 59 хв., для білка обробленого N-етилмаліємідом, і τ = 3, 397 ± 0, 55 хв. для нативного білка. Таким чином, ці результати також підтверджують наше припущення, що латротоксинподібний білок може належати до родини синаптичних білків, що мають N-етилмаліємід-чутливі властивості, а саме – ААА родини АТФаз, що забезпечують транспортні реакції та комплексні перетворення на протязі синаптично-везикулярного циклу.
Дослідження впливу латротоксинподібного білка на роботу потенціалзалежних кальцієвих каналів. Дослідження здатності латротоксинподібного білка впливати на роботу кальцієвих каналів проводили на свіжоізольованих нейронах гіпокампа та клітинах Пуркіньє мозочка щурів лінії Вістар віком 17 та 13 днів, відповідно. Нейрони виділяли за стандартними методиками з використанням слабкої ферментативної обробки з подальшим механічним диспергуванням тканини з допомогою пастерівської піпетки. Експерименти проводили з використанням стандартної методики фіксації потенціалу в умовах внутрішньоклітинного діалізу {Kostyuk P. G. 1981}. Кальцієвий струм Р-типу реєстрували в нейронах Пуркінь’є мозочка. В цьому випадку застосовували позаклітинний розчин, що містив (в мМ) : TEA-Cl – 40, MgCl2 – 2, BаCl2 – 2, Холін-хлорид – 100, Трис-Cl – 20, (pH=7. 4) ; та внутрішньопіпетковий, що містив (в мМ) : Tріс-фосфат – 70, TEA-Cl – 40, Трис-Cl – 20, ЕГТА – 5, MgАТФ – 5, ГТФ – 1-3, (pH=7. 4). Підтримуваний потенціал становив -70 мВ. Після прориву мембрани нейрон перфузували внутрішньопіпетковим розчином на протязі 3 хв до початку стимуляції. Струм викликали ступінчастою деполяризацією мембрани клітини до -25 мВ тривалістю 200 мс з інтервалом 15 с. Після досягнення струмом стаціонарного рівня до зовнішнього розчину додавали латротоксинподібний білок в концентрації 0, 1 мкМ. За таких умов відбувалося швидке збільшення амплітуди кальцієвого струму на 72  4% (Рис. 9). При цьому, аплікація латротоксинподібного білка не призводила до достовірних змін кінетичних параметрів струму. Як видно з рисунків 9 А, В, кінетика наростання та спаду кальцієвого струму залишалася незмінною, а відбувалося лише збільшення амплітуди струму. Відмивання латротоксинподібного білка із зовнішньоклітинного розчину призводило до часткового усування його дії, яке становило близько 29  6% від його максимального значення (n=4)  (Рис. 9, А; 10). Також було перевірено вплив латротоксинподібного білка на потенціал-залежні характеристики кальцієвих струмів Р-типу. Вольт-амперну характеристику отримували при ступінчастій деполяризації мембрани нейронів від підтримуваного потенціалу -70 мВ до різних рівнів з інкрементом 10 мВ, тривалістю 200 мс. На рис. 9 Б представлено узагальнену вольт-амперну характеристику для кальцієвих каналів Р-типу нейронів Пуркін’є мозочка щурів в контролі (крива 1), при дії латротоксинподібного білка в концентрації 10 мкг/мл (крива 2) ; у всіх випадках n=4).
Як видно з рисунку латротоксинподібний білок не впливав на потенціал-залежні характеристики кальцієвого струму Р-типу. Для перевірки, чи такий ефект на Р тип кальцієвого струму, не був обумовлений лише зміною зовнішнього розчину, що містив певну кількість білка, були проведені експерименти, в ході яких використовували відповідну кількість інактивованого латротоксинподібного білка. Інактивований латротоксинподібний білок не впливав на кальцієвий струм Р-типу нейронів Пуркін’є мозочка щурів (Рис. 9). Подальші дослідження властивостей латротоксинподібного білка проводили на високопорогових кальцієвих каналах L-типу. Кальцієвий струм L-типу реєстрували в свіжоізольованих нейронах гіпокампа. В цьому випадку застосовували позаклітинний розчин,
Фото Капча