Дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції

Trikash I., Terletskaya M. Malysheva M. Kolchinskaya L. Kactrykina T. Glyvuk N. Latrotoxin-like brain protein and its fusogenic activity (1997). Biophis. J., 2, 72

 

 

Гливук Н. В. Дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції. -Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 02 – біофізика. – Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 2002.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції. В роботі показано, що латротоксинподібний білок збільшує ступінь АТФ – викликаного злиття гомотипових мембран. Ця властивість латротоксинподібного білка може модулюватися процесами фосфорилювання-дефосфорилювання, зміною рН середовища та шляхом обробки білка N-этилмаліємідом. Встановлено, що латротоксинподібному білку притаманна АТФазна активність, характерна для білків ААА родини АТФаз. Показано, що аплікація 0, 1мкМ латротоксинподібного білка призводила до значного збільшення амплітуди кальцієвого струму Р-типу (біля 72%) та дещо меньшому зростанню струму L-типу (біля 33%). Дослідження впливу латротоксинаподібного білка на спонтанні постсинаптичні відповіді показали, що аплікація 0, 3мкМ білка призводила до деякого зростання амплітуди (44. 6  24. 6%) та значного збільшення частоти (1027  121, 2%) GABAергічних IPSC. Таким чином латротоксинподібний білок можливо здатен брати участь в процесі синаптичної передачі.

Ключові слова: латротоксинподібний білок; синаптична передача; кальцієві канали; АТФазна активність; злиття мембран.

 

Гливук Н. В. Исследования функциональных свойств латротоксинподобного белка как возможного участника процесса нейросекреции. -Рукопись. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 02. – биофизика. – Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертационная работа посвящена изучению функциональных свойств латротоксинподобного белка как возможного участника процесса нейросекреции. В работе было показано, что латротоксинподобный белок увеличивает степень АТФ-вызванного слияния гомотипичных мембран. Это свойство латротоксинподобного белка может модулироваться процессами фосфорилирования-дефосфорилирования, изменением рН среды и обработкой латротоксинподобного белка N-этилмалиемидом. Установлено, что латротоксинподобный белок обладает АТФ-азной активностью, характерной для белков ААА семейства АТФ-аз. Показано что апликация 0, 1мкМ латротоксинподобного белка приводила к значительному увеличению амплитуды кальциевого тока Р- типа (около 72%) и несколько меньшему увеличению тока L-типа (около 33%). Исследования влияния латротоксинподобного белка на спонтанные постсинаптические ответы показали, что приложение 0, 3мкМ белка приводило к значительному увеличению частоты (1027  121, 2%) и небольшому увеличению амплитуды (44. 6  24. 6%) GABAергических IPSC ответов. Таким образом, латротоксинподобный белок, возможно, способен принимать участие в процессе синаптической передачи.

Ключевые слова: латротоксинподобный белок; синаптическая передача; кальциевые каналы; АТФазная активность; слияние мембран.

 

Glyvuk N. V. The investigation of fun ctional properties of the latrotoxin-like protein as a possible participator of the process of neurosecretion. – Manuscript. Thesis for Ph. D. degree on specialty 03. 00. 02 – biophysics. -, O. O. Bogomoletz Institute of Physiology National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

The dissertation work is devoted to the investigation of functional properties of latrotoxin-like protein as a possible participator of process of neurosecretion. For the investigation of latrotoxin-like protein’s ability to affect membrane fusion we used system which contained SM and SV. Our experiments revealed that the application of latrotoxin-like protein led to partial inhibition of ATP-induced membrane fusion. But these data let us to suggest that the behavior of this protein could possibly differ in the system of homotypic membranes (for example in system which contains only SV). Experiments made in such conditions showed that indeed the application of latrotoxin-like protein led to the increase of ATP-induced fusion comparing to control. Taking into account literature data and our results we could suggest that latrotoxin-like protein is similar by its action to some other proteins, namely р97, Sec18 and Cdc48p, which mediate processes of membrane fusion. From the other hand it is known that above mentioned proteins belong to the AAA-family of APTases. Our experiments revealed that Latrotoxin-like protein has ATPase activity and its value is actually the same as in other APTases from AAA-family. This feature of latrotoxin-like protein likewise р97 and NSF greatly depends on pH. We showed that the increase of pH to 8, 1 led to increase of ATPase activity of latrotoxin-like protein. Thus, these data let us to suggest that latrotoxin-like protein can be considered as a member of ААА-family АТР-аses – group of proteins, which mediate processes of membrane fusion. On the next stage of our work we tried to investigate in more details possible mechanisms of the regulation of latrotoxin-like protein activity. We showed that increase of pH to 8. 1 led to almost complete loss of the ability of latrotoxin-like protein to evoke membrane fusion while the decrease рН to 6. 0 significantly amplified this feature. Phosphorilation of latrotoxin-like protein also affected its activity. We showed that at physiological рН phosphorilation of latrotoxin-like protein led to decrease of its fusogenic activity, while at рН 6. 0 this value increased. These data shows that latrotoxin-like protein likewise other synaptic proteins can modulate its activity by the factors, which provide efficiency of proteins in native conditions. On the next part of our work we decided to investigate the influence of latrotoxin-like protein on the Ca2+ channels. Our investigations showed, that application of 0. 1μM of latrotoxin-like protein led to enhance of P-type Ca current for about 72% without any effect on kinetic or potential-dependent parameters of this current. Effect of latrotoxin-like protein could be partly washed out (about 29%). In case of L-type of Ca current application of latrotoxin-like protein in the same concentration also led to increase of current amplitude, but this value was less comparing to P-type Ca current and average was about 33%. This effect could be abolished by the washout of protein from the bath solution. Kinetic and potential-dependent parameters of this current were also unaffected. This data let us to suggest, that latrotoxin-like protein action was more specific for P-type Ca channels than for L-type. To examine possible effect of latrotoxin-like protein on transmitter release, we compared spontaneous GABA-ergic inhibitory postsynaptic currents (IPSC) in hippocampal neurons before and after bath application of the protein (0. 3 M) to the external solution. It can be seen that the frequency of spontaneous GABA-ergic IPSC dramatically increased following application of the latrotoxin-like protein. A pronounced increase in the IPSC frequency was observed in all experiments with no exception. Under control conditions, “miniature” currents were detected with the mean frequency of about 0. 37 Hz, while after application of 0. 3 M latrotoxin-like protein to the external solution the respective frequency of the spontaneous activity reached about 3. 8 Hz. The normalized IPSC frequency increased more than 10 times, as compared with the control. The amplitude of spontaneous responses also tended toward increase in the presence of latrotoxin-like protein. The effect also was observed in all experiments, but was significantly smaller than that on the IPSC frequency (the mean increase was only about 44. 6%).

Thus latrotoxin-like protein may be involved into process of synaptic transmission.

Key words: latrotoxin-like protein; synaptic transmission; calcium channels; ATPase activity; membrane fusion.