Дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції

Предмет:

Тип роботи:

Автореферат

К-сть сторінок:

Мова:

Українська

Оцінка:

що містив (в мМ) : TEA-Cl – 40, MgCl2 – 2, BаCl2 – 20, Холін-хлорид – 100, Трис-Cl – 20, (pH=7. 4) ; та внутрішньопіпетковий, що містив (в мМ) : Трис-фосфат – 70, TEA-Cl – 40, Трис-Cl – 20, ЕГТА – 5, АТФ -Mg2+- 5, ГТФ – 1-3 Трис, (pH=7. 4). Підтримуваний потенціал становив -55 мВ. Після прориву мембрани нейрон перфузували внутрішньопіпетковим розчином на протязі 3-х хв до початку стимуляції. Струм викликали ступінчастою деполяризацією мембрани клітини до 0 мВ тривалістю 50 мс з інтервалом 15с. Після досягнення струмом максимального рівня до зовнішнього розчину додавали латротоксинподібний білок в концентрації 0, 1 мкМ. Це викликало збільшення кальцієвого струму L-типу в середньому на 33  5%, яке повністю усувалося при відмиванні білка із зовнішнього розчину (n=4) (Рис. 11 А, Рис. 12). Також було досліджено вплив латротоксинподібного білка на потенціал-залежні характеристики кальцієвих струмів L-типу. На рис. 11 Б представлено узагальнену вольт-амперну характеристику для кальцієвих каналів L-типу нейронів гіпокампу щурів в контролі (1), при дії латротоксинподібного білка в концентрації 10 мкг/мл (2) та при відмиві білка із зовнішнього розчину (3) ; у всіх випадках n=4. Таким чином, отримані нами результати свідчать про те, що аплікація латротоксинподібного білка на L-тип кальцієвого струму також призводила до збільшення амплітуди струму, а кінетичні та потенціалзалежні характеристики струму залишалися незмінними.

Дослідження впливу латротоксинподібного білка на спонтанну постсинаптичну активність. Для дослідження можливого впливу латротоксинподібного білка на вивільнення нейромедіатора, ми вивчали спонтанні ГАМК-ергічні постсинаптичні струми в нейронах гіпокампа в контролі та після аплікації 0. 3 мкМ білка до зовнішнього розчину. Для виділення гальмівних спонтанних постсинаптичних струмів (“мініатюрна активність“) до зовнішнього розчину додавали 10 мкM CNQX та 50 мкM APV, для блокування іонотропних глутаматних рецепторів, та 1 мкМ ТТХ для блокування натрієвих каналів (Рис. 13, 14) За таких умов в контролі спостерігалась незначна спонтанна активність, частота якої становила близько 0, 37  0, 07 Гц (n=3) (Рис. 13, 14). Аплікація 0, 3мкМ латротоксинподібного білка призводила до значного зростання частоти спонтанної активності, яка становила близько 3, 8  0, 45 Гц (n=3) (Рис. 13, 14, 15 А).

На рисунку 13 представлений частотно-амплітудний розподіл спонтанних постсинаптичних відповідей в контролі та під дією 0, 3мкМ латротоксинподібного білка. Як видно з рисунку, додавання латротоксинподібного білка викликало швидке зростання частоти спонтанних постсинаптичних відповідей, яке дещо спадало з часом (рис. 13, 14). В середньому, зростання частоти спонтанних відповедей відбувалося майже в 10 разів. При цьому також відбувалося зростання їх амплітуди, яке становило близько 44, 6  24, 56% (рис. 15 Б).

Таким чином, отримані нами результати свідчать про те, що латротоксинподібний білок здатен викликати спонтанне вивільнення нейромедіатора, що призводить до зростання частоти та амплітуди спонтанних постсинаптичних відповідей в порівнянні з контрольними значеннями.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ

З літературних даних відомо, що в пресинаптичному закінченні є велика кількість білків, які виконують роль посередників в процесі злиття мембран {Meyer, H. H., et. al. 1998}{Meyer, H. H., et. al. 2000}{Yuan, X., et. al. 2001}{Barnard, R. J., et. al. 1997}{Hanson, P. I., et. al. 1997}. Це білки так званої родини ААА АТФаз – NSF, що опосередковує злиття мембран синаптичних везикул з плазматичними мембранами; р97 – посередник злиття мембран в апараті Гольджі та ендоплазматичному ретикулюмі, та інші{Meyer, H. H., et. al. 2000}{Kondo, H. et. al. 1997}{Roy, L. et. al. 2000}. Їх основна роль полягає в тому, що вони забезпечують дисоціацію білкового SNARE комплексу, який зв‘язує мембрани синаптичних везикул з пресинаптичними мембранами в активній зоні, наближаючи їх одну до одної так, щоб за умови усунення запобіжного механізму могло відбутися їх спонтанне злиття. Такий розвиток подій пропонують автори однієї з гіпотез, що описує злиття мембран в процесі синаптичної передачі {Mayer, Wickner, et al. 1996 }. Отримані нами результати показали, що латротоксинподібний білок підвищував АТФ-ініційоване злиття між собою переважно мембран синаптичних везикул. Це можна пояснити тим, що за цих умов білковий комплекс злиття, який формується між синаптичними везикулами, дещо відрізняється по структурі від комплексу злиття активної зони {Weber, Parlati, et al. 2000}. Ймовірно, це є визначальним для здатності латротоксинподібного білка викликати злиття мембран. Наші результати показали, що латротоксинподібний білок здатен викликати злиття переважно гомотипових мембран, а факторами, які модулюють активність латротоксинподібного білка, є його фосфорилювання та зміна рН середовища. Як відомо з літературних даних, саме цими факторами модулюється функціональна активність синаптичних білків{Greengard, Valtorta, et al. 1993}{Greengard & Browning 1988}{Greengard, Browning, et al. 1987}{Greengard 1978}{Nielander, Onofri, et al. 1995}. Отримані нами результати узгоджуються з даними літератури і свідчать про те, що латротоксинподібний білок здатен змінювати свою активність за рахунок ендогенних модуляторних факторів за тих самих умов, при яких відбувається модулювання активності інших білків активної зони. АТФазна активність латротоксинподібного білка за своєю величиною подібна до описаної раніше для інших білків родини ААА АТФаз {Meyer, Kondo, et al. 1998}. Більш того, дослідження залежності ферментативної активності латротоксинподібного білка від зсуву рН в бік лужного середовищя (умови, що підвищують АТФазну активність білків родини ААА до максимального рівня), показали, що її величина також зростає. При