Застосування полімеразної ланцюгової реакції для діагностики хламідіозу свиней

В мазках-відбитках з головного мозку і легень білих мишей та жовткових міхурів курячих ембріонів, яким вводили супернатант 10% суспензій, приготовлених з мозку, легень та паренхіматозних органів “контактного” та “контрольних” поросят-гнотобіотів, ЕТ хламідій не виявлено.

Результати досліджень матеріалу від поросят-гнотобіотів з досліду по експериментальному відтворенню хламідіозу за загальноприйнятими методами (РЗК, культуральний, гістологічний і мікроскопічний) та ПЛР-аналізу свідчать про те, що практично неефективним на початку розвитку інфекційного процесу в організмі є метод РЗК, а найефективнішим метод ПЛР-аналізу.

З метою перевірки можливості застосування методу ПЛР-аналізу для діагностики хламідіозу свиней, перш за все, була розроблена і відпрацьована методика відбору проб клінічного матеріалу. Для цього були випробувані проби сперми, фекалій, зскрібки з слизової оболонки головки статевого члену і прямої кишки кнурів, зскрібки з слизової оболонки вагіни свиноматок і свинок та абортивний матеріал.

Зскрібки з слизових оболонок відбирали за допомогою одноразових мультизондів “Medscand”, “Акцелон” і “DNC Med”, призначених для взяття зскрібків з слизових оболонок статевих шляхів людини (дані мультизонди дають можливість захоплювати глибокі шари епітелію при мінімальному травмуванні слизової). Як з'ясувалось, вони виявились найбільш придатними для індикації хламідій в досліджуваному матеріалі. Також цілком придатними для виділення ДНК і проведення ПЛР є супернатанти відцентрифугованих 20% суспензій сперми і 10% суспензій внутрішніх органів аборт-плодів або загиблих чи забитих свиней та надосадова рідина, одержана при відмивці фекалій, тоді як цільна сперма для проведення ПЛР-аналізу – непридатна. При дослідженні цільної сперми, не на усіх доріжках електрофореграми виявляється смуга розміром 308 пар нуклеотидів, яка за електрофоретичною рухливістю відповідає внутрішньому контролю реакції, а це свідчить про те, що такі проби містять речовини, які інгібують ампліфікацію. В даному випадку ми вважаємо, що таким чинником може бути надмірна кількість геномної ДНК сперми. А відповідно такі результати не можна вважати достовірними.

При дослідженні за методом ПЛР 28 зскрібків з слизової оболонки статевого члену кнурів-плідників станції штучного осіменіння дослідного господарства Інституту свинарства УААН ім. О. В. Квасницького отримано 18 позитивних та 10 негативних результатів на хламідіоз. Причиною дослідження тварин вказаної станції штучного осіменіння стали аборти (особливо серед перевіряємих свиноматок) та народження мертвих або нежиттєздатнх поросят після осіменіня спермою цих плідників. Поряд з цим, серед кнурів-плідників відмічались поліартрити та кровотечі з препуцію.

Одночасно досліджувались проби сперми від трьох ПЛР-позитивних на хламідіоз кнурів та одного від ПЛР-негативного, з яких було приготовлено мазки, які забарвлювали за методом Стемпа, а також 20% суспензії, супернатант яких культивувався в п'яти послідовних пасажах на білих мишах (по 4 миші на кожну пробу) та курячих ембріонах (по 4 КЕ на кожну пробу).

В мазках із сперми на жодному з препаратів елементарних тілець хламідій не виявлено.

При дослідженні мазків-відбитків, приготовлених з головного мозку та легень мишей починаючи з третього пасажу матеріалу від кнурів, позитивних на хламідіоз при дослідженні методом ПЛР, виявляли множинні включення елементарних тілець хламідій. При дослідженні мазків-відбитків з жовткових міхурів КЕ скупчення ЕТ були виявлені вже в першому пасажі матеріалу від ПЛР-позитивних тварин.

При дослідженні 11 сироваток крові кнурів-плідників вказаної станції штучного осіменніня за методом РЗК з хламідійним антигеном як в розведенні 1: 5, так і в розведенні 1: 10 отримані негативні результати.

Наступним етапом роботи було дослідження клінічних проб від свиноматок та свинок. З метою з'ясування можливості застосування методу ПЛР-діагностики хламідіозу у цієї статевої групи свиней нами спочатку було досліджено вагінальні зскрібки від 12 свиноматок, що належали ПСП “Броварки”, та від 14 свиноматок, що належали агрофірмі “Граніт” Глобинського району Полтавської області.

На свинофермах цих господарств протягом останніх двох років у свиноматок реєструвалися аборти, народження мертвого та нежиттєздатного молодняку і масові ендометрити, пневмонії у поросят, а також фімози та кровотечі з препуцію у кнурів-плідників.

Методом ПЛР-аналізу вказаних проб від свиноматок ПСП “Броварки” було виявлено 10 позитивних і 2 негативних, а з проб від свиноматок агрофірми “Граніт” було виявлено 7 позитивних і 7 негативних результатів на хламідіоз.

Також на хламідіоз за методом ПЛР-аналізу досліджувались вагінальні зскрібки від 15 свиноматок та 14 ремонтних свинок, що належали агрофірмі “Ковалівка” Шишацького району Полтавської області. На цій свинофермі у весняному турі опоросів відмічалось народження слабких поросят живою масою до 700 г з нерозвиненим смоктальним рефлексом. Летальність серед новонароджених досягала 50%. Реєструвались також аборти та мертвонародження. Через 3 місяці, в наступному турі опоросів, серед свиноматок відмічались масові аборти.

При дослідженні сироваток крові від 6 свиноматок, які абортували, в Полтавській державній обласній лабораторії ветеринарної медицини було виключено лептоспіроз та бруцельоз. Разом з тим, усі проби сироваток в РЗК з хламідійним антигеном дали позитивний результат.

Проведено дослідження на хламідіоз ПЛР-методом 40 клінічних проб від 8 кнурів-плідників, 26 свиноматок та 6 ремонтних свинок СТФ ТОВ “Агрофірма ім. Горького” Новомосковського р-ну Дніпропетровської області (дана свиноферма протягом двох років була стаціонарно неблагополучною по хламідіозу). При цьому було виявлено 17 позитивних і 23 негативних результати.

Клінічними пробами від кнурів плідників, які використовувались