Зміни кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при діабетичній нейропатії

Оптична частина установки була змонтована на базі мікроскопа Axioskop, Zeiss, Німеччина. Розділення потоків збуджуючого світла та флуоресценції здійснювалось за допомогою дихроїчного дзеркала. Світло, що пройшло через фільтр у шляху збудження флуоресценції, відхилялось дихроїчним дзеркалом та фокусувалось на об'єкті за допомогою високоапертурного іммерсійного об'єктива (60х, цифрова апертура 0. 9). Відбитий флуоресцентний сигнал, пропускався дихроїчним дзеркалом, і після проходження через інтерференційний фільтр, з максимумом пропускання 510 нм, подавався на ФЕП.

За допомогою модуля попередньої обробки компенсували автофлуоресценцію та підсилювати сигнал, який після цього оцифровувався та зберігався на комп'ютері за допомогою цифрового інтерфейсу TIDA (Гейдельберг, Німеччина).

Розчини і реактиви. Фізіологічний розчин, який використовували для виділення спинного мозку (інкубаційний) містив (у мМ) : NaCl – 125; KCl – 5; CaCl2 – 2. 5; MgSO4 – 1. 5; NaHCO3 – 25; KH2PO4 – 1. 6; глюкоза – 10, рН – 7. 4, при постійному оксигенуванні сумішшю 5% CO2 + 95% O2. Температуру розчину підтримували на рівні 4°С протягом усього процесу виділення та виготовлення зрізів. Базовий фізіологічний розчин, який використовували під час експериментів, а також при фарбуванні зрізів зондом фура-2/АМ містив (у мМ) : NaCl – 128; KCl – 2; CaCl2 – 2. 5; MgSO4 – 1. 5; NaHCO3 – 25; KH2PO4 – 1. 6; глюкоза – 10, рН – 7. 4, при постійному оксигенуванні сумішшю 5% CO2 + 95% O2, температура розчину підтримувалася на рівні 32°С. Безкальцієвий фізіологічний розчин одержували з базового розчину шляхом еквімолярної заміни CaCl2 на MgCl2 та додаванням хелатора Ca2+ – EGTA (5 мМ). В усіх експериментах із зрізами спинного мозку, до базового розчину додавали блокатор потенціал-керованих Na+ каналів – тетродотоксин у концентрації 1 мкМ. Розчин Тироде, який використовували при аплікації агоністів та антагоністів, а також для одержання гіперкалієвого розчину, містив (у мМ) : NaCl – 140; KCl – 4; CaCl2 – 2; MgCl2 – 2; HEPES/NaOH – 5; глюкоза – 10; p – 7. 4. Для одержання гіперкалієвого розчину 50 мМ Na+ у розчині Тироде ізоосмотично заміщали на 50 мМ K+. Фура-2/АМ була одержана від компанії Molecular Probes, (Eugene, OR, США) ; тетродотоксин та тапсигаргін від компанії Alomone Labs Ltd. (Єрусалим, Ізраїль) ; AIDA, CNQX, D-AP5 і PPADS від компанії Tocris-Cookson Ltd. (Брістоль, Великобританія) ; всі інші солі та реагенти від компанії Sigma-Aldrich Chemie Gmb. (Deisenhofen, Німеччина).

 

 

Вимірювання змін больової чутливості. Формаліновий тест. Ноцицептивний стимул створювали підшкірним введенням 20 мкл 5% розчину формаліну в задню кінцівку тварини. Як основні больові реакцій було вибрано реакцію посмикування травмованої кінцівки та її лизання. Після введення формаліну, як у хворих, так і в контрольних щурів розвивалася реакція самочинного посмикування лапки, в яку був введений формалін. При цьому характер розвитку даної реакції достовірно відрізнявся у контрольних щурів та у щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом. У діабетичних тварин спостерігався яскраво виражений двофазний характер відповіді, яка складалася з першої «гострої» фази, тривалістю близько 10 хв., та другої «тонічної» фази перебіг якої, відбувався без яскраво виражених максимумів та припинявся до 85-90 хв. У контрольних тварин спостерігалася практично повна відсутність першої фази, а друга «тонічна» фаза, навпаки, була більш вираженою з одним максимумом на 40-45 хв. (Рис. 1А). Експеримент проведений на 7 контрольних та 5 діабетичних тваринах. Друга больова реакція – лизання вколотої кінцівки, також характерна при виникненні больового рефлексу. Характер розвитку даної реакції був достовірно відрізнявся у контрольних та діабетичних тварин. Лизання лапки в діабетичних щурів теж мало яскраво виражений двофазний характер: перша «гостра» фаза тривалістю 10-15 хв. та друга «тонічна» фаза під час якої було зареєстровано появу локальних максимумів на 25-й, 60-й і 85-й хв. Експеримент проведений на 10 контрольних та 5 діабетичних щурах (Рис. 1Б).

Рисунок 1. Графік перебігу двох больових реакцій. А) Реакція посмикування вколотої кінцівки. Б) Реакція лизання вколотої кінцівки. Графік побудований за усередненими по всім тваринам значенням, одержаним для кожної тварини в кожній точці. Зірочками позначені точки, які відрізняються достовірно, (р<0. 05).

Метод «гаряча поверхня». Дана методика дозволяє оцінити два параметри змін больових поведінкових реакцій щурів. Перший – поріг чутливості до дії больового стимулу, другий – час реакції у відповідь на больовий стимул. Для створення ноцицептивного стимулу експериментальних тварин поміщали на поверхню розігріту до температури здатної викликати больову реакцію. Проявом больової реакції вважали лизання кінцівок, дотичних до нагрітої поверхні. У випадку, коли такої реакції не виникало протягом 10 хв., ми вважали, що дана температура є підпороговою. Було встановлено, що поріг больової чутливості для контрольних та діабетичних щурів не відрізнявся та складав 42°С. При підвищенні температури поверхні від 43 до 47°С не спостерігалося достовірних відмінностей у швидкості больової реакції у тварин, однак уже при 48°С, ці розбіжності досягали достовірності. Так у щурів, яких поміщали на гарячу поверхню з температурою 48°C, час появи больової реакції достовірно відрізнявся та складав 10 ± 0. 8 с (n = 5) і 22 ± 1. 5 с (n = 5), р < 0. 001 (Рис.