+3 8(066) 185-39-18
fПредмет:
Тип роботи:
Автореферат
К-сть сторінок:
28
Мова:
Українська
на тонких зрізах спинного мозку, ефект АТФ може бути замаскований вивільнення глутамата з, оточуючих нейрони, гліальних клітин (Idestrup C. 1998, Salter M. 1995). З метою виключити можливий вплив глутамата, ми використовували позаклітинний розчин, який містив блокатори різноманітних глутаматних рецепторів (100 мкМ AIDA – блокатор метаботропних глутаматних рецепторів mGlu1, mGlu5; 30 мкМ D-AP5 – блокатор іонотропних глутаматних рецепторів NMDA типу та 10 мкМ CNQX – блокатор інотропних глутаматних рецепторів AMPA типу). Додавання 200 мкМ АТФ у бескальциєвий розчин, який містив AIDA, CNQX і D-APV, супроводжувалось транзиєнтним збільшенням [Ca2+]i в нейронах дорзального рога спинного мозку. Причому, це збільшення не відрізнялося достовірно від збільшення, що спостерігається, без додавання вищевказаних речовин у безкальцієвий позаклітинний розчин (n = 8, Рис. 5Б). Таким чином, одержані нами результати свідчать про можливість використання аплікації АТФ, як адекватного функціонального тесту
InsР3-чутливого шляху вивільнення Ca2+ з депо ЕР. Амплітуда [Ca2+]i транзиєнтів викликаних дією 200 мкМ АТФ у фізіологічному розчині складала 237 ± 24 нМ (n = 30) у нейронах контрольних тварин та 226 ± 23 нМ (n = 17) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом, різниця між амплітудами не була статистично достовірною (Рис. 6). При додаванні АТФ до безкальцієвого розчину спостерігалось достовірне зменшення амплітуди кальцієвих транзиєнтів від 156 ± 14 нМ (n = 45) за контрольних умов до 104 ± 6 нМ (n = 21) за умов експериментального діабету (Рис. 6). Зменшення амплітуди АТФ-індукованих [Ca2+]i транзиєнтів у безкальцієвому розчині складало 34 ± 6% (n = 17) у нейронах контрольних тварин порівняно з нейронами щурів з експериментальним діабетом (p<0. 01). Аналогічні експерименти були проведені для вивчення дії глутамата на іонотропні та метаботропні рецептори в контрольні та за умов експериментально-викликаного діабету. Амплітуда [Ca2+]i транзиентів, викликаних дією 100 мкМ глутамата в фізіологічному розчині, складала 216 ± 19 нМ (n = 14) у нейронах контрольних тварин та 145 ± 20 нМ (n = 7) у нейронах діабетичних щурів (Рис. 6). Аплікація глутамата в безкальцієвому розчині супроводжувалась достовірним зменшенням амплітуди кальцієвих транзиєнтів від 176 ± 21 нМ (n = 13) за контрольних умов до 80 ± 15 нМ (n=9) за умов експериментально-викликаного діабету (Рис. 6). Амплітуда Ca2+ транзиєнтів, викликаних глутаматом у безкальціевому розчині зменшувалась на 54 ± 6% (n = 17) у діабетичних тварин порівняно з контрольними (p<0. 01).
Ефект іономіцину. Для дослідження ємності Ca2+ депо ЕР, ми використовували антибіотик іономіцин. Іономіцин у концентраціях менших чи рівних 1 мкМ призводить до вивільнення Ca2+ з обох типів депо ЕР за ріанодин та InsР3 незалежним механізмом (Albert P. 1986). Амплітуда [Ca2+]i транзиєнтів викликаних дією 1 мкМ іономіцину складала 188 ± 25 нМ, (n = 8) у нейронах контрольних тварин та 85 ± 13 нМ (n = 6) у нейронах тварин із СТЗ-індукованим діабетом. Різниця між амплітудами була статистично достовірною (р < 0. 001, Рис. 6). Гістограма, яка відображає активацію різних шляхів вивільнення Ca2+ з ЕР та їх зміни за умов експериментального діабету, представлена на рисунку 6.
Рисунок 6. Гістограма змін амплітуди [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних аплікацією активаторів вивільненя Ca2+ з депо эндоплазматического ретикулума в контролі та діабеті. *-відповідає критерію достовірності р < 0. 01, **- р < 0. 001
Роль Ca2+-АТФази ендоплазматичного ретикулуму. При апроксимації спаду Ca2+ транзиентів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в присутності 10 мкМ СССР, з'ясувався яскраво виражений дво-експонентний характер його спаду (Рис. 7). Як у нейронах контрольних тварин, так і в нейронах тварин із СТЗ-індукованим діабетом, у спаді кальцієвого транзиентів були присутні «швидка» та «повільна» експоненти. Сталі часу спаду «швидких» експонент не відрізнялися достовірно та складали 6. 3 ± 2. 2 с. (n = 15) у нейронах контрольних тварин та 8. 4 ± 3. 1 с (n = 13) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом. В той же час, сталі часу спаду «повільної» компоненти складали 92 ± 40 с (n = 15) у контрольних та 315 ± 75 с (n = 13) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом відповідно (р < 0. 01). При апроксимації спаду Ca2+ транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в присутності 10 мкМ СССР та 1 мкМ тапсигаргіну (специфічного блокатора Ca2+-АТФазы ЕР), з'ясувалося, що цей спад є моно-експоненціальним (Рис. 7). Сталі часу спаду експонент не відрізнялися (з точністю до похибки методу) та складали 75 ± 33 с (n = 6) у нейронах контрольних тварин та 81 ± 41 с (n = 6) у нейронах щурів із СТЗ-індукованим діабетом. Отже, при блокуванні Ca2+-АТФази ЕР зникає різниця у швидкості виведення кальцію з цитоплазми, між нейронами контрольних та діабетичних тварин, що свідчить про важливу роль Ca2+-АТФази ЕР у процесах, які лежіть в основі порушення Ca2+ гомеостазу за умов експериментального діабету.
Рисунок 7. Апроксимація спаду [Ca2+]i транзиєнту у контролі та за умов експериментально-викликаного діабету. На кожному графіку представлена суперпозиція спадів 5 транзиєнтів, побудованих у напівлогарифмічному масштабі та нормалізованих до 1. А) в присутності 10 мкМ СССР Б) в присутності 10 мкМ СССР та 1 мМ тапсигаргіну.
Обговорення
Поведінкові тести, на сьогоднішній день, є єдиним джерелом інформації про больову чутливість тварин. В