Зміни кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при діабетичній нейропатії

Рисунок 2. Час появи больової реакції при температурі гарячої поверхні 48°С.

Зміни кальцієвої сигналізації в ноцицептивних нейронах за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Характер змін кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією. В ході досліджень [Ca2+]i у вторинних ноцицептивних нейронах, розташованих в ділянках ламіни I та substantia gelatinosa дорзального рога спинного мозку, не було виявлено істотної відмінності рівня базального кальцію в контрольних та діабетичних тварин. Деполяризацію клітин викликали аплікацією гіперкалієвого розчину з концентрацією іонів К+ – 50 мМ. Істотної різниці значень пікових амплітуд та часу наростання кальцієвих транзиєнтів, викликаних деполяризацією, у контрольних та діабетичних тварин виявлено не було. Основна відмінність в характеристиці деполяризаційних [Ca2+]i транзиєнтів у нейронах дорзального рога спинного мозку була виявлена при дослідженні кінетики їх спаду. Рівень залишкового [Ca2+]i, який реєстрували на 90-й с. після початку деполяризації, був достовірно вищим у діабетичних тварин та складав (у відсотках від піка викликаного деполяризацією Ca2+ транзиєнта) 14. 1 ± 1. 2% (n = 25) порівняно з 2. 8 ± 0. 5% (n = 25) у контрольних тварин (р<0. 001, Рис. 3).

Рисунок 3. [Ca2+]i транзиєнти, викликані 20 с аплікацією позаклітинного розчину з підвищеним (50 мМ) змістом іонів К+ А) у контрольних умовах і Б) за умов експериментально-викликаного діабету.

Зміни внеску різних типів Са2+ каналів плазматичної мембрани в генерацію [Ca2+]i транзиентов за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Ефект ніфедіпіну. Амплітуда, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів, яка не відрізнялась у контрольних та діабетичних тварин, під час дії 50 мкМ ніфедіпіну (блокатора L-типу Ca2+ каналів) зменшувалась на 31 ± 5% (n = 18) та на 65 ± 3% (n = 13) у нейронах контрольних та діабетичних щурів відповідно. Різниця між ефектами ніфедіпіну була достовірною (p<0. 001, Рис. 4).

Ефект w-конотоксину. Для визначення змін внеску потенціал керованих кальцієвих каналів у генерацію, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів, ми використовували специфічний блокатор N-типу високопорогових Ca2+ каналів – w-конотоксин GVIA. Дія 1 мкМ w-конотоксину викликала зменшення амплітуди [Ca2+]i транзиентів, викликаних деполяризацією мембрани клітин на 23 ± 4% (n=8) у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом зменшення було достовірно більшим – 40 ± 3% (n=11). Різниця між ефектами w-конотоксину була достовірною (p<0. 01, Рис. 4).

Сумісна дія нифедипину та w-конотоксину. Для перевірки, чи відрізняються мішені дії цих блокаторов, ми використовували сумісне додавання нифедипину та w-конотоксину. Сумісна дія 1 мкМ w-конотоксину та 50 мкМ ніфедіпіну супроводжувалась зменшенням амплітуди [Ca2+]i транзиентів, викликаних деполяризацією мембрани клітин, на 52 ± 5% (n=8) у нейронах контрольних тварин, у той час як у нейронах щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом дане зменшення складало 78 ± 8% (n=8). Різниця між ефектами w-конотоксину була достовірною (p<0. 01, Рис. 4).

Ефект іонів нікелю. Іони нікелю використовувалися як блокатор низькопорогових Ca2+ каналів Т типу. Іони нікелю викликали недостовірне зменшення амплітуди [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних деполяризацією як у контрольних так і у діабетичних тварин. Гістограма, яка відображає дію блокаторів різних типів кальцієвих каналів та зміни їх дії за умов експериментально-викликаного діабету, представлена на рисунку 4.

Рисунок 4. Гістограма зменшення [Ca2+]i транзієнтів, викликаних деполяризацією, блокаторами потенціал – керованих Ca2+ каналів.

Зміни функціонування мітохондрій. Для дослідження ролі мітохондрій у кальцієвій сигналізації ми використовували роз'єднувач протонного градієнта на внутрішній мембрані мітохондрій, що призводить до припинення захоплення [Ca2+]i мітохондріями – карбоніл-цианід-м-хлорофеніл гідрозон (СССР), у концентрації 10 мкМ. Амплітуда, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів у нейронах дорзального рога спинного мозку при додаванні СССР у концентрації 10 мкМ складала 1249 ± 69 нМ (n = 22) у контрольних тварин та 827 ± 45 нМ (n = 22) за умов експериментального діабету. Різниця між амплітудами [Ca2+]i транзиєнтів була статистично достовірною (p < 0. 001, Рис. 5А).

Рисунок 5. А) [Ca2+]i транзиєнти, викликані 10 с аплікацією гіперкалієвого розчину в присутності блокатора уніпортера мітохондрій – СССР 10 мкМ. Б) [Ca2+]i транзиєнти, викликані 10 с аплікацією 200 мкМ АТФ у безкальцієвому розчині та після інкубації зрізу протягом 2х хвилин у безкальцієвому розчині з блокаторами метабо- та іонотропних глутаматних рецепторів (AIDA 100мкМ, CNQX 10мкМ, D-APV 30мкМ).

Зміни у функціонуванні кальцієвих депо ендоплазматичного ретикулуму. Ріанодин-чутливе депо Ca2+. Для вивчення роботи ріанодин-чутливого депо, ми використовували кофеїн, що знижує поріг активації ріанодинового рецептора кальцієм до рівня, якого достатньо щоб базальний [Ca2+]i викликав його активацію та наступне вивільнення Ca2+ з депо. Амплітуда [Ca2+]i транзиєнтів, викликаних аплікацією 30 мМ кофеїну, була достовірно меншою в нейронах діабетичних тварин – 41 ± 8 нМ (n = 13), ніж у контрольних нейронах – 268 ± 18 нМ (n = 17). Різниця в між амплітудами була статистично достовірною (р < 0. 001, Рис. 6).

Ins3 – чутливе депо Ca2+. Сучасні дослідження показали що, як для глутамата, так і для АТФ існують відповідні метаботропні рецептори, активація яких призводить до вивільнення Ca2+ з депо ЕР через інозитолтрифосфатний шлях. Додавання 200 мкМ АТФ до безкальцієвого зовнішньоклітинного розчину призводило до транзиєнтного збільшення [Ca2+]i у 59% нейронів, які були чутливими до дії АТФ у фізіологічному розчині (45 нейронів із 76). Одначе, з огляду на те, що експерименти проводили