Зміни кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при діабетичній нейропатії

4. Фармакологічне дослідження внеску потенціал-керованих Ca2+ каналів у генерацію Ca2+ транзиєнтів, викликаних деполяризацією, показало, що їх внесок відрізняється у контрольних та діабетичних тварин. Інгібування Ca2+ каналів L- та N- типу, відповідними специфічними блокаторами, зростає під час діабету, тоді як внесок каналів Т типу не змінюється.

5. Виявлено достовірні зміни Ca2+ акумулюючої функції мітохондрій, у діабетичних тварин порівняно з контрольними. Зменшення амплітуди, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів при роз'єднанні протонного градієнта на мембрані мітохондрій складало 78%.

6. Показано достовірне зменшення вивільнення Ca2+ з ріанодин-чутливого депо ЕР, яке у діабетичних тварин складало 85%. Останнє підтверджується зменшенням [Ca2+]i транзиентів у відповідь на аплікацію іономіцину, яке складало 54%.

7. Виявлено достовірне пригнічення функціонування InsР3-чутливого депо ЕР в нейронах дорзального рога щурів із стрептозотоцин-індукованим діабетом. Зменшення амплітуди метаботропного АТФ-індукованого Ca2+ транзиєнта складало 34%, а метаботропного глутамат-індукованого – 54%.

8. При блокуванні Ca2+-АТФази ЕР за допомогою тапсигаргіна зникає різниця у швидкості виведення Ca2+ з цитоплазми, між нейронами контрольних та діабетичних щурів, що свідчить про важливу роль Ca2+-АТФази ЕР у процесах, які викликають порушення кальцієвого гомеостазу за умов експериментального діабету.

9. Виявлені порушення кальцієвої сигналізації у вторинних сенсорних нейронах дорзального рога спинного мозку, можна розглядати як один з механізмів змін передачі больових сигналів при цукровому діабеті, які призводять до розвитку діабетичної нейропатії.

За одержаними результатами було опубліковано такі праці:

1. N. V. Voitenko, E. P. Kostyuk, I. A. Kruglikov, N. V. Svichar, V. A. Shishkin (1999) Changes in calcium signalling of mammalian nociceptive neurons under diabetes. // Phyziol. Journ. (Kiev), 45 (4), 45-54.

2. N. V. Voitenko, I. A. Kruglikov, E. P. Kostyuk and P. G. Kostyuk (2000) Effect of streptozotocine-induced diabetes on activity of calcium channels in rat dorsal horn neurons // Neuroscience 95 (2), 519-524.

3. P. G. Kostyuk, A. S. Efimov, E. P. Kostjuk, N. V. Voitenko, I. A. Kruglikov (2000) Changes in intracellular turnover of calcium ions in nociceptive neurons in experimental diabetes and influence of blockers of potential-dependent calcium channels upon them // Ukrainian acad. of med. Sci. Journ 6 (4), 637-650.

4. Kruglikov, I. A., Shutov, L. P., Shishkin, V. O., Kostyuk, E. P., Potapenko, E. S., and Voitenko, N. V. (2001) Intracellular mechanisms of changes in the functioning of rat sensory neurones with streptozotocin-induced diabetes mellitus. // Phyziol Journ, (Kiev), 47 (5), 18-25.

 

 

Кругликов І. А. Зміни кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при діабетичній нейропатії. – Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидату біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 02 – біофізика. – Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. Київ-2002.

Дисертація присвячена дослідженню змін кальцієвoї сигналізації у нейронах дорзального рогу спинного мозку щурів при індукції діабетичної нейропатії. Результати дисертаційної роботи отримані за допомогою сукупності сучасних методів флуоресцентного вимірювання концентрації кальцію, та двох поведінкових тестів. Виявлено достовірні зміни больової поведінки діабетичних щурів, а саме доведена наявність у них термічної гіпоалгезії та збільшення больової чутливості при реакції на гострий біль під час формалінового тесту. Зареєстровані істотні зміни Ca2+ сигналізації під час експериментального діабету у вторинних сенсорних нейронах. Ці зміни стосуються сповільнення спаду, викликаних деполяризацією [Ca2+]i транзиєнтів, збільшення вкладу L- та N – типу Ca2+ каналів у їх генерацію, а також значне зменшення вивільнення Ca2+ з Ca2+-акумулюючих структур клітини (ріанодин та InsP3- чутливих депо ендоплазматичного ретикулуму та мітохондрій). Одержані результати свідчать про достовірні зміни Ca2+ гомеостазу у вторинних сенсорних нейронах щурів під час діабетичної нейропатії, які., цілком ймовірно, є однією з причин розвитку патології.

Ключові слова: діабет, нейропатії, Ca2+ канали, ріанодин, мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум.

 

Кругликов И. А. Изменения кальциевой сигнализации в нейронах дорзального рога спинного мозга крыс при диабетической нейропатии. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 02 – биофизика. – Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины. Киев-2002.

Диссертация посвящена исследованию изменениям кальциевой сигнализации в нейронах дорзального рога спинного мозга крыс при развитии диабетической нейропатии. Наличие нейропатии было показано при помощи двух поведенческих тестов, измерение внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]i) в нейронах дорзального рога на тонких срезах спинного мозга проводилось с использованием двухволнового флуоресцентного Ca2+ зонда – фура-2/АМ. Диабет вызывался однократной внутрибрюшинной инъекцией стрептозотоцина в концентрации 80 мг/кг веса животного.

При исследовании болевых реакций крыс, проведенных с использованием формалинового теста, обнаружены достоверные изменения в болевой чувствительности крыс со стрептозотоцин – индуцированным диабетом. Динамика изменений болевой реакции у диабетических животных, в отличии от контрольных, приобретала четко выраженный двухфазный характер. Интенсивность первой фазы, продолжавшейся 10-15 минут и физиологически соответствующей начальной острой боли, была достоверно выше у диабетических животных. Интенсивность второй «тонической» фазы, наоборот, была достоверно выше у контрольных крыс и имела максимум на 30 – 40 минуте.

При исследовании болевых реакций крыс, проведенных с использованием метода «горячей поверхности», установлено, что термический болевой порог не отличался для контрольных животных и животных со стрептозотоцин – индуцированным диабетом и составил 42°С, что свидетельствует об отсутствии у диабетических животных термической аллодинии. Скорость болевой реакции на надпороговой температуре в 48°С, была достоверно меньше у диабетических животных, что свидетельствует о наличии у них термической гипоалгезии.

При сравнении [Ca2+]i транзиентов, вызванных гиперкалиевой деполяризацией в клетках дорзального рога спинного мозга, не было обнаружено достоверной разницы между контрольными и диабетическими животными в базальном уровне [Ca2+]i, в амплитуде деполяризационных транзиентов а также в скорости нарастания Ca2+ сигнала. Однако достоверные отличия выявлены в уровне остаточного Ca2+, который составлял 2. 8±0. 5% и 14. 1±1. 2% от амплитуды деполяризационного транзиента, для контрольных и диабетических животных соответственно.

При проведении фармакологического исследования вклада потенциал – управляемых Ca2+ каналов в генерацию Ca2+ транзиента было обнаружено, что их вклад различен у контрольных и диабетических животных. Угнетение L- и N- типов, соответствующими специфическими блокаторами, достоверно растет с течением диабета, в то время как угнетение Т типа Ca2+ каналов остается на одном уровне.

Были обнаружены достоверные изменения в Ca2+ аккумулирующей функции митохондрий у диабетических животных по сравнению с контрольными. Уменьшение амплитуды деполяризационного Ca2+ транзиента при разобщении протонного градиента на внутренней мембране митохондрий составило 78%.

Показано достоверное уменьшение [Ca2+]i выброса из рианодин – чувствительного депо эндоплазматического ретикулума, вызванного приложением кофеина, которое у диабетических животных составило 85%. Данные исследования также подтверждались уменьшением [Ca2+]i транзиента в ответ на приложение кальциевого ионофора – иономицина, которое составило 54%. Показано наличие в нейронах дорзального рога спинного мозга метаботропных пуринорецепторов, из которых около порядка 40% составляют рецепторы P2Y1 подтипа. Выявлено достоверное угнетение функции InsP3 – чувствительного депо, активируемого метаботропными рецепторами в нейронах дорзального рога у крыс со стрептозотоцин – индуцированным диабетом. Уменьшение амплитуды метаботропного АТФ – индуцированного транзиента составило 54%, а метаботропного глутамат – индуцированного транзиента – 38%

При блокировании с помощью специфического блокатора тапсигаргина – кальциевой АТФазы эндоплазматического ретикулума, исчезает разница в скорости выведения кальция из цитоплазмы, между контрольными нейронами и нейронами крыс со стрептозотоцин – индуцированным диабетом, что свидетельствует о важной роли кальциевой АТФазы эндоплазматического ретикулума в процессах вызывающих нарушения кальциевого гомеостаза при диабете.

Выявленные нарушения внутриклеточной кальциевой сигнализации во вторичных сенсорных нейронах дорзального рога спинного мозга, можно рассматривать как один из механизмов изменения передачи болевых сигналов при сахарном диабете, ведущий к развитию диабетической нейропатии.

Ключевые слова: диабет, нейропатии, Ca2+ каналы, рианодин, митохондрии, ендоплазматический ретикулум.

 

Kruglikov I. A. Changes of calcium signaling in rat dorsal horn neurons under diabetic neuropathy. – Manuscript.

Thesis for Ph. D. degree on specialty 03. 00. 02 – biophysics. – Bogomoletz Institute of Physiology NASc of Ukraine. Kiev-2000.

The dissertation is devoted to the investigation of changes of calcium signaling in secondary sensory neurons from the spinal cord of rats with diabetic neuropathy. The results of given study were obtained using fluorescence techniques of intracellular calcium concentration measurements and two behavioral tests. We have shown significant changes in the pain sensitivity and the behavior of diabetic animals, in particular we described the presence of thermal hypoalgesia and increased pain sensitivity under the acute phase of formalin test. We uncovered significant changes in Ca2+ signaling in secondary nociceptive neurons under the experimental diabetes. Given changes are pertinent to the prolongation of the decay stage of depolarization-induced [Ca2+]i transients, increased contribution of L- and N- types calcium channels in generation of depolarization-induced [Ca2+]i transients and significant decrease in Ca2+ release from the Ca2+ -accumulating systems of the cell (ryanodin- and InsP3- sensitive stores of endoplasmic reticulum, mitochondria). The results obtained testify to the significant changes of Ca2+ homeostasis in rat secondary sensory neurons under the diabetic neuropathy, it seems plausible that given changes could be the reason of decease development.

Key words: diabetes, neuropathy, Ca2+ channels, ryanodine, mitochondria, endoplasmic reticulum.