Дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції

Обробка результатів експериментів. Результати статистичної обробки експериментальних даних представлені як середнє арифметичне ± стандартна похибка середнього арифметичного (n – кількість експериментів). Дані апроксимувались різними функціями із використанням програмного забезпечення Origin.

Результати досліджень.

Модулювання злиття мембран під впливом латротоксинподібного білка. Для дослідження здатності латротоксин-подібного білка впливати на процес злиття мембран використовували систему, що містила синаптичні везикули та мембрани синаптосом. Було показано, що при додаванні латротоксинподібного білка до цієї системи відбувалося часткове пригнічення процесу злиття (Рис. 1 (крива 2)). Вже на другу хвилину інкубації гальмуюча дія латротоксинподібного білка на АТФ-індуковане злиття синаптичних везикул та мембран синаптосом становила близько 22% від контрольного рівня і далі зростала з часом інкубації. Ці результати дозволили нам припустити, що для латротоксинподібного білка може бути характерна поведінка подібна до таких білків родини ААА АТФаз, як р97 або Cdc48p; білків, що опосередковують злиття виключно гомотипових мембран. Для перевірки цього припущення ми використали систему що містила лише синаптичні везикули. Додавання латротоксинподібного білка до інкубаційного середовища призводило до підвищення відносного проценту злиття мембран (рис. 2). За першу хвилину інкубації відбувалося збільшення ефективності злиття синаптичних везикул на 33% і потім, на протязі подальшої інкубації, відбувалося лише збільшення відносного проценту злиття пропорційно до контрольних значень (рис. 2). Так відносний процент злиття мембран в контролі та під впливом латротоксинподібного білка на першу хвилину інкубації становив 9% та 12%, відповідно, і потім зростав до 12% та 16% на 2 хвилину, 14% /18% – на 3 хвилину і 15% /20% – на 4 хвилину інкубації. Постійна часу наростання процесу злиття становила τ=1. 118 ± 0. 06 хв. для контроля, та τ=1. 126 ± 0. 086 хв. при дії білка. Таким чином отримані нами результати дають змогу зробити припушення, що подібно білкам р97 та Cdc48p, латротоксинподібний білок може впливати на процес злиття гомотипових мембран.

Дослідження АТФ-азної активності латротоксинподібного білка. З літератури відомо, що вищезгадані білки р97 та Cdc48p належать до ААА родини АТФаз. Це дозволило нам припустити, що латротоксинподібний білок також здатен проявляти АТФазну активність і може виконувати роль подібну до відомих білків родини ААА АТФаз. Дослідження показали, що латротоксинподібний білок дійсно проявляє АТФазну активність (рис. 3, крива 1). Додавання латротоксинподібного білка до інкубаційного середовища, що містило АТФ, призводило до вивільнення неорганічного фосфату. Було показано, що при рН 7. 4 процес гідролізу АТФ досягав максимальної швидкості, яка становила 0, 140 мкмольPi / мг латротоксинподібного білка / хв. Таким чином наші дослідження показали що АТФазна активність латротоксинподібного білка становить близько 4-6 мкмольРі/мг білка/годину, що відповідає таким значенням для білків ААА родини АТФаз, що описані в літературі. Крім того, як відомо з літератури, рН середовища є фактором, який суттєво змінює активність білків. Так, максимум АТФазної активності для білків ААА родини проявляється при зсуві рН в бік лужного середовища. Дослідження впливу рН на активність латротоксинподібного білка показали, що так само як і в випадках р97 та NSF, підвищення рН до 8, 1 призводило до значних змін АТФазної активності латротоксинподібного білка (рис. 3, 4). Максимальна швидкість гідролізу АТФ латротоксинподібним білком при рН 8, 1 становила 0, 132 мкмольPi / мг білка / хв. Збільшення концентрації латротоксинподібного білка в інкубаційному середовищі призводило до пропорційного зростання кількості вивільненого фосфату за одиницю часу і мало лінійну форму. Таким чином, отримані нами результати свідчать, що латротоксинподібний білок має АТФазну активність і можливо належить до родини ААА-АТФаз, білків, які опосередковують злиття мембран.

Модулюючий вплив рН середовища на здатність латротоксинподібного білка викликати злиття негативно заряджених ліпосом. Найбільш зручною моделлю для досліджень модулювання здатності латротоксинподібного білка викликати злиття гомотипових мембран є система ліпосом. Нами було показано, що зміни рН середовища мають значний вплив на активність латротоксинподібного білка та його здатність викликати злиття від’ємно заряджених ліпосом. Як видно з рисунку 5, підвищення рН до 8. 1 призводило до майже повної інактивації впливу білка. Інкубування на протязі 6 хвилин призводило лише до незначного злиття ліпосом, що становило близько 1, 2%; тоді як в контрольних умовах при рН 7, 4 відносний процент злиття вже на першу хвилину інкубації становив 3%, а до 6 хвилини збільшувався до 17%. Це свідчить про те, шо навіть при досить незначному зсуві рН в лужну область відбуваються значні конформаційні зміни в молекулі білка, що призводять до інактивації здатності латротоксинподібного білка викликати злиття штучних мембран. Однак зсув рН в бік кислого середовища мав зворотній ефект. Так при