Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13

Практичне значення одержаних результатів полягає в можливості використання відібраних Pel+-форм як основи для виробництва біопрепаратів комплексної дії для використання в рослинництві. За результатами наших досліджень встановлено, що дана форма краще колонізує корені рослин з поверхні та із середини, а також має більший позитивний вплив на ростові характеристики рослин. Розроблений метод ідентифікації на основі ПЛР має велике практичне значення через його швидкість, надійність та можливість ідентифікувати K. oxytoca у складних популяціях бактерій.

Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано особисто автором або за його безпосередньої участі у плануванні та проведенні експериментів.

Апробація результатів. Матеріали дисертації пройшли апробацію на 10-му Міжнародному конгресі з азотфіксації (Санкт-Петербург, Росія, 1995), 7-му Конгресі з біотехнології (Ніца, Франція, 1995), 1-4-й Європейських конференціях з азотфіксації (Сегед, Угорщина, 1994; Познань, Польща, 1996; Люнтерен, Нідерланди, 1998; Севілья, Іспанія, 2000), Міжнародному науковому семінарі з охорони довкілля (Ужгород, 2001) та інших наукових зібраннях.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 статей та тези 10 доповідей у збірниках міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, трьох розділів, в яких подано отримані результати та їх обговорення, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 118 сторінках машинописного тексту. Вона містить 22 рисунки та 15 таблиць. Список використаної літератури охоплює 134 джерела.

 

 

Матеріали і методи дослідження.

У роботі використовували штами: Klebsiella oxytoca VN13, K. oxytoca ATCC 13183, K. pneumoniae ATCC 13883, K. planticola ATCC 33531, Escherichia coli JM109, E. coli DH5α, E. coli JM109 pir, E. coli S17-1 pir, Erwinia carotovora subsp. carotovora 8982, E. carotovora subsp. atroceptica 9027, E. chrysanthemi 8183. Як поживне середовище для вирощування бактерій використовували LB. При дослідженні пектолітичних функцій використовували мінімальне середовище М9 з 0, 2% гліцерином. При необхідності додавали полігалактуронат натрію (ПГН) або глюкозу до концентрації 0, 2% та вітамін В1 до 0, 0005% при вирощуванні штамів E. coli. Для виявлення пектиназної активності використовували чашки з середовищем Логана або з кальційстабілізованим поліпектатним гелем (Starr, 1977).

Ферменти рестрикції BamHI, BglI, NotI, EcoRI, HindIII, PstI, XbaI, SalI, MluI фірми “Fermentas” та SacI, Sau3A, HpaII фірми “Pharmacia Biotech”, ДНК-полімеразу І, ДНК-лігазу фага T4, лужну фосфатазу фірми “Boehringer Mannheim”, фрагмент Кльонова ДНК-полімерази І, Taq-полімеразу та екзонуклеазу Bal31 фірми “Fermentas” використовували за приписом виробника. Гель-електрофорез, елюцію ДНК з гелю та перенос фрагментів ДНК з агарозного гелю на нейлонову мембрану для блот-гібридизації здійснювали за стандартними методиками (Sambrook et al., 1988). Гібридизацію здійснювали з використанням набору для мічення та детекції фірми “Boehringer Mannheim”, в якому використовується дигоксигенінова мітка.

Приготування і зберігання компетентних клітин, а також трансформацію, здійснювали за методом Нішімура (Nishimura, 1990).

Підбір праймерів для ідентифікації K. oxytoca VN13 методом ПЛР та аналіз термодинамічних характеристик олігомерів здійснювали за допомогою програми “Gene Runner 3. 00”. В реакційній суміші використовували стандартний буфер для Taq-полімерази, додаючи дезоксинуклеотидтрифосфати до концентрації 0, 2 мМ та MgCl2 до 2, 5 мM. Зміна концентрації іонів Мg++ в діапазоні 1-4 мМ не впливала на вихід і чистоту продуктів реакції. Ампліфікацію виконували на приладі “Gene ATAQ Controller”. Оптимальні параметри програми: попередня денатурація – 95 С – 2 хв, потім цикл: 94 С – 20 с, 59 С – 30 с, 72 С – 20 с, що повторювався 25 – 35 разів, залежно від концентрації ДНК в пробі. За зразки для ПЛР-аналізу використовували очищені препарати ДНК та температурні лізати бактерій, що отримували інкубуванням відмитої бактеріальної суспензії на водяній бані при 100 С протягом 3 – 4 хв.

Нуклеотидну послідовність ДНК визначали за методом Сенгера (Sanger et al., 1977) з використанням автоматичного секвенатора ALF Express та набору для секвенування “Cy5 AutoCycle” (“Pharmacia Biotech”) Для аналізу визначеної нуклеотидної послідовності та виведеної амінокислотної послідовності полігалактуронази використовували програму “Gene Runner 3. 00”. Аналіз гомології ДНК та поліпептидного продукту здійснювали, використовуючи комп’ютерні програми blastn та blastx електронної служби Blast 2. 0 Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) США. Пошук промоторів здійснювали за допомогою програми NNPP (Neural Network Promoter Prediction)  (http: //www. fruitfly. org/seq_tools/promoter. html). Аналіз N-кінця первинного транслянта проводили за допомогою програми SignalP-HMM (http: //www. cbs. dtu. dk/services/SignalP-2. 0).

Полігалактуроназну активність визначали за збільшенням концентрації вільних альдегідних груп, яку визначали фериціанідним методом (Starr, 1977). За одиницю активності брали таку кількість ферменту, що вивільняє 1 мМ альдегідних груп при 37 С за 1 хв. в реакційній суміші такого складу: 0, 5% ПГН; 0, 05 М Na (CH3COO)  (pH 5, 2) ; 0, 2 M NaCl. Пектатліазну активність визначали за поглинанням ненасичених продуктів реакції при довжині хвилі 235 нм у реакційній суміші: 0, 23% ПГН; 0, 1 М трис-HCl (pH 8, 5) ; 0, 3 M CaCl2. За одиницю активності брали кількість