Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13

Зернівки пшениці стерилізували препаратом “Білизна” протягом 20 хв, поверхню корінців проростків – 5 хв. Для визначення кількості асоційованих бактерій наважку кореня розтирали в керамічній ступці з невеликою кількістю 0, 8% NaCl і висівали різні розведення на чашки із селективним середовищем.

Результати дослідження та їх обговорення.

1. Пектолітичні ферменти K. oxytoca VN13. Характеристика Pel+-клонів. Наявність пектолітичних ферментів у K. oxytoca VN13 було показано за допомогою тесту з використанням середовища Логана та підтверджено кількісним методом. Як субстрат використовували полігалактуронат натрію (ПГН), що є основою пектинових полімерів. Використовуючи фериціанідний метод визначення відновлювальної здатності розчинів, що дає можливість визначення концентрації вільних альдегідних груп як міри ступеня деградації ПГН, встановлено, що лізат K. oxytoca VN13 має два піки пектолітичної активності – в кислій та лужній ділянках рН (рис. 1). Це вказує на наявність як полігалактуроназної (ПГ), так і пектатліазної (ПЛ) активностей.

Метод визначення ПЛ-активності, що базується на поглинанні продуктів деградації субстрату цим ферментом при =235 нм, підтвердив, що тільки пік в лужній ділянці рН є результатом дії пектатліаз. Таким чином K. oxytoca VN13 має дві основні групи ферментів, що деполімеризують ПГН.

Встановлено, що більшість клітин лабораторного штаму K. oxytoca VN13 не має здатності засвоювати ПГН як єдине джерело вуглецю. Але з частотою 10-7 – 10 -5 в популяціях K. oxytoca VN13 виявлялись клітини, які здатні до росту з утворенням клонів на мінімальному середовищі з ПГН. Даний фенотип, позначений нами як Рel+, вказує на наявність в K. oxytoca VN13 всього комплексу генів катаболізму ПГН, але деякі з них знаходяться в криптичному стані, а їх активація відбувається внаслідок певних генетичних змін. При культивуванні Рel+-клонів на середовищі LB в популяції з’являються клітини дикого типу, які швидко витісняють Рel+-форми в процесі росту культури. При дослідженні властивостей Рel+-клонів K. oxytoca VN13, увагу привернули три особливості цих бактерій: 1) Рel+-клони мали втричі вищий рівень ПЛ- активності; 2) при обробці такими бактеріями насіння пшениці ефективність колонізації внутрішніх тканин коренів проростків була значно вищою, порівняно з диким типом; 3) Рel+-клони мали більший позитивний вплив на ріст проростків (табл. 1).

 

Таблиця 1

Властивості Рel+-клонів Klebsiella oxytoca VN13

Штам

K. oxytoca VN13 Активність

ПЛ Вміст всередині коренів, куо/г Маса проростків пшениці, г

Pel- 0, 113 2, 8 • 103 12, 73 ± 0, 37

Pel+ 0, 328 3, 1 • 104 13, 13 ± 0, 41

Необроблений бактеріями контроль 10, 85 ± 0, 05

 

З наведених результатів випливає, що існує певний зв'язок між рівнем пектолітичної активності, здатністю бактерій до колонізації внутрішніх тканин коренів та стимуляцією росту рослин.

2. Клонування та визначення нуклеотидної послідовності pehX-гена. Банк генів K. oxytoca VN13 створювали на основі плазміди pBluescriptSKM. Для цього проводили неповний гідроліз хромосомної ДНК рестриктазою Sau3A, елюювали з агарозного гелю фрагменти розміром від 3 до 10 тис. п. н. та лігували з вектором, лінеаризованим BamHI. Сумішшю трансформували компетентні клітини E. coli JM109. Серед 4500 рекомбінантних клонів виявлено один, що занурювався на чашках з кальційстабілізованим поліпектатним гелем, а отже мав пектолітичну активність.

Виділена з даного клону плазміда pBluS2 містила вставку близько 3, 5 тис. п. н. геномної ДНК K. oxytoca VN13. При додаванні ізопропілтіогалактозиду як індуктора векторного промотора рівень експресії пектолітичної функції не підвищувався, що вказувало на експресію гена з власного промотора. Пектолітична функція не проявлялась при наявності глюкози в середовищі, що вказувало на катаболітну репресію. Експресія клонованого гена в E. coli мала прояви токсичної дії продукту на цю бактерію, тому, для забезпечення стабільності наслідування, фрагмент було переклоновано в плазміду pK18, що несе ген резистентності до канаміцину, з утворенням плазміди pKS2. Кількісне визначення пектолітичної активності показало відсутність ПЛ-активності і наявність ПГ-активності. Дані вимірювання, які подано в табл. 2, показують, що K. oxytoca VN13, як і E. coli DH5, з даною плазмідою мають в 5 разів вищий рівень ПГ-активності, ніж дикий тип K. oxytoca VN13.

 

Таблиця 2

Активність полігалактуронази, мМ • хв-1 • мл-1

Штам Загальна У супернатанті

E. coli DH5 (pKS2) 0, 0164 0, 0011

K. oxytoca VN13 (pK18) 0, 0031 -

K. oxytoca VN13 (pKS2) 0, 0149 0, 0034

 

Субклони клонованого фрагмента (рис. 2), створені відповідно до встановлених сайтів рестрикції (pBluS2H, pBluS2R, pKRS2, pKPS2, pKS2ΔP, pUCMHS2, pKRMS2) та з використанням екзонуклеази Bal31 для вкорочення MluI-HindIII фрагмента (pBlu0. 7Bal, pBlu0. 9Bal, pBlu1. 0Bal, pBlu1. 4Bal), використовували для визначення нуклеотидної послідовності клонованого гена. Визначену нуклеотидну послідовність (2541 п. н.), що містить відкриту рамку зчитування (1974 п. н.), промоторну (237 п. н.) та прилеглу до 3'-кінця (330 п. н.) ділянки, зображено на рис. 3.

3. Аналіз первинної послідовності кодованого білка. Виведена з послідовності ДНК клонованого фрагмента амінокислотна послідовність становить 658 амінокислотних залишків (рис. 3), а розрахована молекулярна маса 71, 9 кДа. Аналіз N-кінця показав наявність типової для сигнального