+3 8(066) 185-39-18
fПредмет:
Тип роботи:
Автореферат
К-сть сторінок:
25
Мова:
Українська
що вищеплюється даною рестриктазою. Це надає цілковитої впевненості в походженні фрагмента, з яким прогібридизував зонд. Після відповідної обробки дану мембрану було використано повторно для гібридизації з фрагментом pehX-гена. Гібридизація показала, що клони №1 і №3 не відрізняються в даному локусі від дикого типу. Гібридизаційна смуга з ДНК клону №2, розщепленої рестриктазою SalI, міститься вище, що відповідає важчому фрагменту через інсерцію cat-гена (3, 4 тис. п. н.). Гібридизаційна смуга у варіанті з рестриктазою BamHI знаходиться нижче у клону №2, ніж у дикого типу. Це пояснюється тим, що фермент BamHI вищеплює вставку та розбиває фрагмент з pehX-геном мутанта на дві частини, з однією з яких і гібридизується даний зонд.
Цей експеримент доводить, що: по-перше, клон №2 є неактивним мутантом по pehX-гену з інсерцією в кодуючій частині даного гена і не містить його нативної копії; по-друге, дана інсерція є єдиною індукованою нами зміною геному K. oxytoca VN13; по-третє, K. oxytoca VN13 має одну копію pehX-гена з даною нуклеотидною послідовністю.
Дослідження здатності pehX--мутанта засвоювати ПГН як єдине джерело вуглецю показали його повну тотожність, за цією ознакою, до дикого типу K. oxytoca VN13. Pel+-форми виникали з тією ж частотою, що й у дикого типу. Pel+-клони мутанта ефективно засвоювали ПГН у разі відсутності інших джерел органічного живлення. Отже експресія клонованого pehX-гена не є необхідною для засвоєння ПГН, що добре узгоджується з літературними даними.
Мутант перевіряли на ефективність колонізації внутрішніх тканин коренів рослин. Насіння пшениці обробляли сумішшю мутантного та дикого типів K. oxytoca VN13 в наближено рівних пропорціях. Фактичне співвідношення визначене експериментально склало 49 до 51. Протягом чотирьох тижнів спостерігали за співвідношенням дикого та мутантного штамів на поверхні, а також усередині коренів рослин. Клітини мутанта легко відрізнити завдяки їх резистентності до хлорамфеніколу. Дослід проводили в стерильних умовах. Отримані результати, які подано в табл. 4, свідчать, що продукт клонованого гена не впливає на ефективність колонізації. Так співвідношення загальної кількості клітин дикого і мутантного штамів після 10 днів вегетації суттєво не змінилося. Всередину коренів обидва типи клітин проникали однаково ефективно. Природньо, що у разі значимості досліджуваної пектинази для процесу проникнення всередину тканин коренів рослин, співвідношення змінювалося б на користь дикого типу бактерій. З табл. 4 видно, що цього не відбувається і через 3 тижні вегетації. Відсоток клітин мутантного штаму навіть збільшився з 49% до 57, 5%. Поряд з цим, частка мутантних клітин від загальної кількості бактерій в асоціації теж збільшилась до 57%.
Таблиця 4
Порівняння ефективності колонізації коренів проростків пшениці диким типом та pehX- -мутантом
Зразок для аналізу Відсоток клітин мутанта (Cmr) від загальної кількості бактерій
10 днів 21 день 28 днів
Необрооблені стерилантом корені 49, 5 57, 5 39, 0
Оброблені з поверхні стерилантом корені 50, 0 57, 0 49, 0
Примітка. В інокуляті містилось 49% мутантних клітин
Дані про співвідношення клітин дикого і мутантного типів K. oxytoca VN13 при колонізації рослин у змішаній популяції вказують на відсутність впливу pehX-гена на процес взаємодії з рослинами в умовах даного досліду. Такий результат можна пояснити екзоспецифічністю даного ферменту щодо характеру розщеплення субстрату та його периплазматичною локалізацією. Проте, характер даного досліду не дає можливості стверджувати, що досліджуваний ген зовсім не бере участі в даних процесах. Існує певна ймовірність компенсації функції диким штамом K. oxytoca VN13. Дослід з варіантами, де рослини були б оброблені окремо різними штамами, не дав достовірних результатів через відносність визначення внутрішньотканинної частки бактерій в асоціації. Тому дане питання потребує подальшого вивчення.
6. Використання послідовності pehX-гена для розробки методу ідентифікації K. oxytoca на основі ПЛР. Унікальність послідовності pehX-гена K. oxytoca VN13, відсутність значної гомології його нуклеотидної послідовності з будь-якими іншими ДНК-послідовностями, що депоновані в електронних базах даних, дали можливість використати дану послідовність для розробки праймерів для ідентифікації цієї бактерії методом полімеразної ланцюгової реакції.
Для розробки праймерів використовували програму “Gene Runner 3. 00”, де аналізували нуклеотидну послідовність першої частини pehX-гена, що була визначена на той час. Пари праймерів були підібрані за такими критеріями: 1) близька за значенням температура плавлення та гібридизації всіх чотирьох олігомерів для можливості формування чотирьох пар праймерів; 2) підвищена стабільність 3'-кінця праймера в дуплексі з матричною ДНК для ефективної ініціації елонгації олігомера Taq-полімеразою; 3) відсутність стабільних дуплексів між праймерами та внутрішніх вторинних структур олігомерів при кімнатній температурі; 4) розмір ампліконів повинен бути зручним для їх розділення та ідентифікації в агарозному гелі. Відібрані за цими критеріями олігонуклеотиди PEH-A (5'-ggactacgccgtctatcgtcaag-3'), PEH-B (5'-aatatccagggtcatatcgctgtg-3'), PEH-C (5'-gatacggagtatgcctttacggtg-3'), PEH-D (5'-tagcctttatcaagcggatactgg-3') давали можливість отримувати чотири різні продукти, оскільки вони мають близькі термодинамічні характеристики.
Розміщення послідовності даних нуклеотидів на ДНК pehX-гена стосовно один одного зображено на рис. 8. Розміри продуктів ПЛР у реакції з хромосомною ДНК K. oxytoca VN13, обраховані в “Gene Runner 3. 00” становлять для пар: РЕН-А, РЕН-В – 451 п. н. ; РЕН-С, PEH-D – 344 п. н. ; РЕН-А, PEH-D – 513 п. н. ; РЕН-С, РЕН- В – 282 п. н.
Продукти такого розміру легко ідентифікувати електрофорезом в агарозному гелі (рис.