Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13

Аналіз гомології амінокислотної послідовності даного білка за допомогою програми blastp виявив значну кількість гомологічних послідовностей з різним рівнем гомології. Найбільш значимі результати даного аналізу відображені в таблиці 3. Досліджувана амінокислотна послідовність має найвищий рівень гомології з первинними послідовностями екзо-ПГ представників родини Enterobacteriaceae. Дещо нижчий рівень подібності з досліджуваною послідовністю мають аналогічні ферменти більш віддалених з філогенетичної точки зору видів. Значно нижчою є гомологія з ендо-ПГ. До того ж, протяжність гомологічних відрізків зменшується до 400 амінокислотних залишків порівняно з 590 для екзо-ПГ. Дані факти дозволяють стверджувати, що клонований нами ген кодує пектолітичну гідролазу з екзосубстратною специфічністю. За аналогією до відповідного ферменту E. chrysanthemi даний ген названо pehX.

 

Таблиця 3

Подібність амінокислотної послідовності полігалактуронази K. oxytoca VN13 до відповідних білків інших бактерій

Мікроорганізм Характер розщепл.

субстрату Величина гомол. послід.

(амінокислот) Рівень

подібності, % 

Yersinia enterocolitica екзо- 587 66

Erwinia chrysanthemi екзо- 594 65

Pectobacterium chrysanthemi екзо- 594 65

Ralstonia solanacearum екзо- 591 57

Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes екзо- 588 49

Erwinia carotovora subsp. сarotovora ендо- 403 38

Rhizobium vitis ендо- 386 37

 

4. Аналіз регуляторних елементів pehX-гена. У визначеній нами ДНК послідовності, кодуючій частині pehX-гена передує 237 п. н., GC-вміст у даному фрагменті ДНК низький, що характерно для промоторних ділянок прокаріотів, і становить 37%. На рис. 4 зображено промоторну ділянку і відносне розташування трьох ймовірних промоторів, що визначені за допомогою програми NNPP, при цьому з рисунка видно, що тільки перші два з них ініціюють утворення транскрипту, що містить сайт зв’язування з рибосомою UAAGGA на 5’-кінці. Ініціація синтезу мРНК з третього промотора була б недоцільною.

На даному відрізку ДНК нами було виявлено дві операторні ділянки для зв’язування регулятора транскрипції KdgR (див. рис. 4), що є основним регулятором пектинолізису E. chrysanthemi. Аналогічний білок є репресором при катаболізмі гексуронових кислот і у E. coli. При цьому модуляція транскрипції з промоторів пектиназних генів E. chrysanthemi зберігається в E. coli, а амінокислотні послідовності KdgR з цих двох організмів ідентичні на 90%. Все це вказує на високу консервативність KdgR, а отже, і консервативність послідовності сайта-мішені. Тому ми порівнювали послідовність промоторної ділянки досліджуваного гена з консенсусною послідовністю для зв’язування KdgR E. chrysanthemi (рис. 5). Положення KdgR-операторів щодо старту транскрипції та трансляції вказує на зарепресованість даного оперона у разі відсутності індукторів.

5. Створення та вивчення властивостей pehX--мутанта. Неактивний мутант K. oxytoca VN13 по pehX-гену отримували заміщенням методом гомологічної рекомбінації in vivo природньої послідовності pehX-гена на інсерційний мутант, отриманий in vitro інсерцією гена резистентності до хлорамфеніколу cat. Для цього в ЕсоRІ сайт, що лежить у першій половині кодуючої частини pehX-гена плазміди рBluS2H (див. рис. 2), було клоновано ЕсоRІ фрагмент плазміди рНР45Сm, розміром 3, 4 тис. п. н., який кодує ген саt. У клонах E. coli DH5α з новоутвореною плазмідою рBluS2: : Сm (рис. 6) ПГ-активність не було виявлено. Отже, pehX було інактивовано.

Як вектор для доставки мутантного гена в хромосому було використано плазміду рJP5603, що потребує для реплікації допоміжного білка π, і підтримується тільки в спеціальних штамах E. coli. У полілінкер цієї плазміди було перенесено SalІ/SacІ фрагмент плазміди рBluS2: : Сm, що містить pehX-ген з інсерцією. Отриману плазміду рJPpeh: : Сm використовували для створення pehX--мутанта K. oxytoca VN13 in vivo (див. рис. 6).

З штаму E. coli S17-1 pir плазміду рJPpeh: : Сm було перенесено кон’югацією в K. oxytoca VN13. Даний реплікон не підтримується в цій бактерії, тому всі транскон’юганти містили інсерцію плазміди в сайті локалізації гена pehX. Плазмідної ДНК в даних клонах виявлено не було. Нативна копія втрачається при внутрішній рекомбінації між частинами різних копій гена із втратою векторного маркера резистентності до канаміцину та збереженні резистентності до хлорамфеніколу. Три таких клони було відібрано та перевірено їх генетичну конструкцію методом блот-гібридизації.

Для виявлення гена стійкості до хлорамфеніколу як зонд використовували SmaI-фрагмент плазміди рНР45Сm розміром 1, 7 тис. п. н. Для ідентифікації гена pehX використовували PstI/EcoRV-фрагмент цього гена розміром 1, 0 тис. п. н. Гібридизація з геном cat показала, що тільки один з вірогідних мутантів, а саме №2, має цей ген в хромосомі. Клони №1 і №3 мали значно нижчий рівень стійкості до хлорамфеніколу, що можна пояснити спонтанними мутаціями. З рис. 7 видно, що cat-ген представлений у даного мутанта однією копією. Гібридизаційна смуга у варіанті № 2/BamHI відповідає розміру фрагмента вставки з cat-геном в pehX,