Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13

Пари праймерів РЕН-А, PEH-D (513 п. н.) та РЕН-С, PEH-D (344 п. н.) застосовували для проведення ПЛР з ДНК інших представників роду Klebsiella та роду Erwinia. При електрофорезі продукти реакції були виявлені тільки у варіантах з K. oxytoca (рис. 10). Цей результат вказує на видоспецифічність даних праймерів, а тому розроблений метод придатний для ідентифікації K. oxytoca.

 

 

1. Встановлено позитивну кореляцію між рівнем пектолітичної активності K. oxytoca VN13, ефективністю колонізації цією бактерією коренів рослин та рівнем її впливу на ріст проростків пшениці.

2. Виділено Pel+-форми K. oxytoca VN13 з підвищеною пектолітичною активністю та ефективністю колонізації коренів пшениці. Підвищена концентрація бактерій на поверхні та всередині коренів позитивно впливає на ріст проростків пшениці, що робить перспективним використання даних форм бактерій для виготовлення біопрепаратів.

3. Створено плазмідний банк генів K. oxytoca VN13 та ідентифіковано клон з екзополігалактуроназною активністю. Визначено повну нуклеотидну послідовність клонованого та прилеглих ділянок ДНК, що, в цілому, становить 2541 н. п.

4. Проаналізовано промоторну ділянку гена pehX та визначено регуляторні елементи, які вказують на існування KdgR -регулона в K. oxytoca VN13.

5. Створено мутант з інактивованим pehX-геном, який зберігав здатність до колонізації внутрішніх тканин коренів рослин, що можна пояснити екзосубстратною специфічністю відповідного ферменту та його периплазматичною локалізацією. Даний мутант також зберігав здатність до засвоєння полігалактуронату натрію.

6. На основі унікальності визначеної послідовності ДНК pehX-гена, розроблено праймери та відпрацьовано методику ідентифікації K. oxytoca методом ПЛР.

 

 

1. Петак А. М., Ковтунович Г. Л., Козыровская Н. А., Туряница А. И., Кордюм В. А. Взаимоотношения бактерий рода Klebsiella с растением. 2. Локализация бактерий Klebsiella oxytoca и K. terrigena в тканях табака и пшеницы // Биополимеры и клетка. – 1995. – Т. 11, № 6. – C. 75-79.

2. Kozyrovska N., Kovtunovych G., Gromosova E., Kuharchuk P., Kordyum V. Novel inoculants for an environmentally-friendly crop production // Resources, Conservation and Recycling. – 1996. – Vol. 18. – P. 79-85.

3. Kovtunovych G., Lar O., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Enhancing the internal plant colonization rate with endophytic nitrogen-fixing bacteria // Биополимеры и клетка. – 1999. – Т. 15, № 4. – С. 300-305.

4. Kovtunovych G., Lar O., Kamalova S., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N.. Correlation between pectate lyase activity and ability of diazotrophic Klebsiella oxytoca VN13 to penetrate into Plant Tissues by // Plant and Soil. – 1999. – Vol. 215. – P. 1-6.

5. Ковтунович Г. Л., Лар О. В., Козировська Н. О. Клонування та структурний аналіз peh-гена Klebsiella oxytoca VN13 // Биополимеры и клетка. – 2000. – Т. 16, № 5. – С. 356-362.

6. Kovtunovych G. L., Lar О. V.,. Kozyrovska N. О. Ecologicaly-frendly crop production with microbial inoculаnts. III. Molecular detection of Klebsiella oxytoca in the environment // Науковий вісник Ужгородського національного університету. Серія біологія. – 2001. – № 9. – С. 79-80.

7. Ковтунович Г. Л., Лар О. В., Козировська Н. О. Роль гена екзополігалактуронази у процесах взаємодії Klebsiella. oxytoca VN13 з коренями проростків пшениці // Біополімери і клітина. – 2002. – Т. 18, № 4. – С. 319-323.

8. Kovtunovych G., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Correlation between pectate lyase activity and penetration inside the plant tissue in diazotrophic klebsiellas // Third European Nitrogen Fixation Conference. – Lunteren (The Netherland). – 1998. – P. 181.

9. Kovtunovych G., Lar О., Kozyrovska N. Molecular mechanisms of diazotrofic Klebsiella oxytoca enter inside the plant tissue: the role of polygalacturonase and pectate lyase // Fourth European Nitrogen Fixation Conference. – Seville (Spain). – 2000. – P. 151.

 

 

Ковтунович Г. Л. Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13. – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 22 – молекулярна генетика. – Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2002.

У роботі викладено результати досліджень пектолітичної системи ендофітної бактерії K. oxytoca VN13, що застосовується як основа біопрепаратів для рослин. Встановлено зв'язок між рівнем пектолітичної активності цієї бактерії, рівнем внутрішньотканинної колонізації та ефективністю її впливу на рослину-асоціат.

Клоновано та визначено нуклеотидну послідовність гена pehX, що кодує гідролітичний фермент екзополігалактуроназу. Проведено аналіз регуляторних елементів даного гена. Встановлено наявність kdgR-регулона в даній бактерії. Аналіз виведеної амінокислотної послідовності кодованого білка вказує на існування сигнального пептиду в первинному транслянті. Створено неактивний мутант по pehX гену та досліджено його участь у процесах катаболізму пектину та взаємодії з коренями рослин.

Унікальність нуклеотидної послідовності клонованого гена використано для розробки методу ідентифікації K. oxytoca на основі полімеразної ланцюгової реакції.

Ключові слова: Klebsiella oxytoca, пектиназа, полігалактуроназа, pehX.

 

 

Ковтунович Г. Л. Клонирование и анализ структуры и функций гена экзополигалактуроназы эндофитной бактерии Klebsiella oxytoca VN13. – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 22 – молекулярная генетика. – Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2002.

В диссертации изложены результаты исследований пектолитической системы эндофитной бактерии K. oxytoca VN13, которая используется для производства биопрепаратов широкого спектра действия для растений. Эффект положительного влияния данного микроорганизма на рост растений обеспечивается способностью к фиксации атмосферного азота и продукции ауксиноподобных веществ. Ферменты, деградирующие компоненты клеточной стенки растений, рассматриваются как возможные факторы проникновения бактерий во внутренние ткани растений.

Выделены Pel+-клоны с повышенным уровнем базовой пектолитической активности K. oxytoca VN13. Исследование этих клонов показало их повышенную способность колонизовать внутренние ткани корней растений. В то же время наблюдается усиление положительного влияния на рост проростков растений по сравнению с исходным типом.

Клонирован один из генов (pehX) пектолитической системы K. oxytoca VN13, который кодирует гидролитический фермент экзополигалактуроназу. Определена полная нуклеотидная последовательность данного гена и примыкающих участков геномной ДНК. Осуществлен компъютерный анализ области регуляции транскрипции данного гена. Анализ регуляторных элементов pehX-гена указывает на существование в K. oxytoca VN13 kdgR-системы глобального регулирования процесса катаболизма пектина и других компонентов клеточной стенки растений. Проанализирован уровень гомологии выведенной аминокислотной последовательности первичного транслянта РehX с известными последовательностями аналогичных белков из других микроорганизмов.

С целью исследования функций pehX-гена был создан неактивный инсерционный мутант. Изучение мутантного штамма показало, что исследуемый ген не является необходимым для процесса усвоения полипектата как источника углерода. Изучена эффективность колонизации внутренних тканей корней растений диким и мутантным типом K. oxytoca VN13 в смешанной популяции. При этом преимущества дикого типа перед мутантным не обнаружено, что может быть связано с несущественностью наличия данного фермента для процесса внутритканевой колонизации. Такой результат можно объяснить периплазматической локализацией данного фермента, а также его екзоспецифичностью по отношению к субстрату. Не исключается также наличие в условиях смешанной популяции полной компенсации утерянной мутантом функции за счет дикого типа бактерий, что требует дальнейших исследований.

Отсутствие существенной гомологии нуклеотидной последовательности клонированного pehX-гена с какими-либо известными последовательностями из других микроорганизмов позволило разработать метод идентификации K. oxytoca на основе полимеразной цепной реакции. Использование четырех подобранных праймеров позволяет идентифицировать данный микроорганизм в чистой культуре и в смешанной популяции, а также дифференцировать K. oxytoca среди близкородственных организмов при уточнении систематического положения природных изолятов бактерий.

Ключевые слова: Klebsiella oxytoca, пектиназа, полигалактуроназа, pehX

 

 

Kovtunovych G. L. Cloning and analysis of structure and function of exopolygalacturonase gene of endophytic bacteria Klebsiella oxytoca VN13. – Manuscript.

 

The thesis aims a PhD degree in molecular genetics (speciality 03. 00. 22) to be awarded. – Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kiev, 2002.

This manuscript presents results of investigation of pectolytic system of K. oxytoca VN13, the endophytic bacterium, which is used for inoculant production. Correlation between the bacterial pectolytic activity value, the level of internal colonisation and the bacterial effect to plants have been detected.

The pehX gene, coding for exopolygalacturonase was cloned and sequenced. Analysis of the regulatory elements of this gene was accomplished, and the presence of the regulatory sites for KdgR was shown for this bacterium. Analysis of the deduced amino acid sequence for PehX enables to predict existence of the signal sequence in the N-terminus of premature protein. The mutant, defective in PehX production has been constructed, and a role it plays in pectin catabolism and in bacterium-plant interaction was investigated. Uniqueness of the DNA sequence of pehX, was used to develop the method of K. oxytoca differentiation.

Key words: Klebsiella oxytoca, pectinase, polygalacturonase, pehX.