Дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції

Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця

 

Гливук Наталія Валентинівна

 

УДК 612. 822: 611. 813. 14

 

 

03. 00. 02 – біофізика

 

Автореферат дисертації на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук

 

Київ – 2002

 

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі нейрохімії Інститута фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України. 

Науковий керівник: доктор біологічних наук МАЛИШЕВА Маргарита Костянтинівна Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України зав. відділом нейрохімії.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, академік НАН України КРИШТАЛЬ Олег Олександрович Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран.

Доктор медичних наук, професор ГРОМОВ Леонід Олександрович Інститут фармакології та токсикології Медичної Академії Наук України зав. відділом нейрофармакології.

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, м. Київ.

Захист відбудеться ” 15 ” жовтня 2002 р. о ”__14___” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26. 198. 01 при Інституті фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інститута фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця 4.

 

 

Актуальність теми. Хімічна синаптична передача є основною формою міжклітинного сполучення в нервовій системі. Вивільнення нейромедіатора відбувається за рахунок процесу регульованого екзоцитозу, як відповідь на підвищення внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Цей процес є результатом цілого ряду так званих рухових реакцій синаптичних везикул, кожна з яких, в свою чергу, опосередковується роботою багатьох білків. За останнє десятиріччя було відкрито велику кількість білків, що беруть участь у цих процесах. Ці білки умовно можна поділити на кілька окремих груп, згідно з особливостями їх дії. Дослідження їх структурних та функціональних властивостей за допомогою біохімічних, генетичних та молекулярно-біологічних методів дозволили скласти детальну картину міжмолекулярних взаємодій певних факторів, що лежать в основі процесу вивільнення нейромедіатора. Однак, незважаючи на велику кількість досліджень, що спрямовані на розуміння тонких механізмів регуляції процесу синаптичної передачі, багато питань залишаються відкритими. Одним з них є питання про те, що ж, насамперед, безпосередньо викликає процес злиття синаптичних везикул з мембраною клітин. За останні півтора десятка років було відкрито декілька білків – посередників злиття різного типу мембран. Це білки ААА родини АТФаз – NSF, що опосередковує злиття мембран синаптичних везикул з плазматичними мембранами, р97 – посередник злиття мембран в апараті Гольджи та ендоплазматичному ретикулюмі, та інші. Проведені раніше дослідження свідчать про те, що ще одним претендентом на роль посередника злиття є цитоплазматичний білок нервових клітин, названий латротоксинподібним. Своєю назвою він завдячує α-латротоксину – діючому компоненту отрути паука каракурта. Цей компонент є відомим ініціатором масованого вивільнення нейромедіатора з пресинаптичного закінчення і з яким латротоксинподібний білок має спільні антигенні детермінанти. Попередні дослідження показали, що цей білок відзначається не лише деякою структурною подібністю, а і наявністю характерних для α-латротоксину властивостей. Тому детальне дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка можливо допоможе з’ясувати його місце в процесі вивільнення нейромедіатора. Це, в свою чергу, значною мірою поповнить інформацію щодо білків – учасників синаптичної передачі, і внесе деяке розуміння в питання щодо механізму вивільнення нейромедіатора – ключового процесу, що забезпечує міжклітинне сполучення в нервовій системі та між нейронами та іншими акцепторними клітинами.

Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу нейрохімії Інститута фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України: “Вивчення злиття штучних та біологічних мембран в модельних системах”.

Мета роботи. Метою роботи було дослідити функціональні властивості латротоксинподібного білка на модельних системах штучних та біологічних мембран, свіжоізольованих нейронах гіпокампа та мозочка, та культурі клітин гіпокампу.

Завдання роботи.

1. Дослідити вплив різних факторів на злиття мембранних структур в умовах in vitro.

2. Дослідити здатність латротоксинподібного білка модулювати злиття мембран.

3. Дослідити АТФ-азну активність латротоксинподібного білка.

4. Дослідити модулюючий вплив рН середовища та фосфорилювання латротоксин-подібного білка на його здатність викликати злиття негативно заряджених ліпосом.

5. Дослідити вплив латротоксинподібного білка на роботу потенціалзалежних кальцієвих каналів.

6. дослідити вплив латротоксинподібного білка на спонтанні постсинаптичні відповіді.

Наукова новизна роботи. З використанням модельних систем штучних та біологічних мембран показано, що латротоксинподібний білок викликає злиття мембран, а факторами, що за цих умов регулюють його активність, є процес фосфорилювання та зміна рН середовища інкубації. Окрім цього показано, що латротоксинподібний білок здатен проявляти АТФазну активність. З використанням методу фіксації потенціалу в конфігурації “ціла клітина” показано, що латротоксинподібний білок здатен викликати збільшення амплітуди потенціалзалежних кальцієвих струмів Р- та L-типів, при цьому кінетичні параметри цих струмів залишаються незмінними. З використанням нейронів культури гіпокампа встановлено, що латротоксинподібний білок викликає спонтанне вивільнення нейромедіатора, що виражається в значному зростанні частоти та амплітуди спонтанних постсинаптичних потенціалів.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані дані щодо можливої участі латротоксинподібного білка в процесі