Застосування полімеразної ланцюгової реакції для діагностики хламідіозу свиней

На підставі лабораторних та господарських дослідів доведено принципову можливість використання методу полімеразної ланцюгової реакції з використанням наборів реактивів, призначених для діагностики хламідійних інфекцій людини, з метою ефективної лабораторної діагностики хламідіозу свиней.

За матеріалами досліджень розроблені “Методичні рекомендації по діагностиці хламідіозу свиней методом полімеразної ланцюгової реакції з застосуванням набору фірми “Літех”, які затверджені Державним департаментом ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України. До Держдепартаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики України подано низку пропозицій до проекту “Інструкції по заходах з профілактики і ліквідації хламідіозу сільськогосподарських тварин”.

Запропоновані і впроваджені схеми лікувально-оздоровчих заходів від хламідіозу свиней в 6 господарствах Полтавської та Дніпропетровської областей.

Особистий внесок здобувача Експериментальні дослідження, аналіз отриманих результатів та їх узагальненя виконані автором особисто. Освоєння і опрацювання методу ПЛР для діагностики хламідіозу свиней проведені в творчій співдружності з фахівцями лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О. В. Квасницького УААН.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були повідомлені та обговорені на: – І міжвузівській конференції молодих вчених і аспірантів “Інфекційна патологія молодняку сільськогосподарських тварин і птиці”, 9-11 червня 1999 р., м. Суми; – Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених “Стан та перспективи розвитку ветеринарної науки”, 6-7 жовтня 1999 р., м. Харків; – Всеукраїнській науково-практичній конференції молодих вчених “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення”, 11 жовтня 2000 р., м. Київ; – III Міжнародній конференції «Біоресурси та віруси», 11-15 вересня 2001 року, м. Київ; – ІІ Всеукраїнській науково-практичній конференції ветеринарних патологів, 21-24 листопада 2001 р., м. Київ; – засіданнях вченої ради Інституту ветеринарної медицини УААН (1997-2002 рр), м. Київ; – міжлабораторному засіданні ІВМ УААН, 13 вересня 2001 р, м. Київ.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, з них 5 (3 одноосібних) статей у фахових наукових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 145 сторінках комп'ютерного тексту. Вона містить 28 таблиць, 27 рисунків і складається зі вступу, огляду літературних джерел та вибору напрямків досліджень, матеріалів та методів досліджень, результатів власних досліджень, висновків, списку використаних літературних джерел, який нараховує 105 джерел, з них 75 іноземних, та додатків.

 

 

На захист виносяться наукові дані, одержані здобувачем за останні 5 років. Робота виконувалась на базі Полтавського філіалу Інституту ветеринарної медицини УААН, лабораторії генетики Інституту свинарства ім. О. В. Квасницького УААН, лабораторій біотехнології і клінічної біохімії та вивчення хворб великої рогатої худоби Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, лабораторії вірусології Полтавської обласної лабораторії ветеринарної медицини та 10 сільськогосподарських підприємств різних форм власності Полтавської та Дніпропетровської областей.

Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). В основі методу ПЛР лежить комплементарна добудова ДНК – мішені, обмеженої специфічними праймерами, що здійснюється in vitro за допомогою ферменту ДНК-полімерази.

При застосуванні нами ПЛР для діагностики хламідіозу ДНК-мішенню є фрагмент ДНК хламідії, праймерами – олігонуклеотиди, комплементарні ділянкам генів, що кодують 16S рPHK, які мають універсальну довжину для усіх видів хламідій [Pollard D. R. et al., 1989, Kaltenboeck B. et al., 1993, Meijer A., 2000, Башмакова М. А. і співавт., 2001].

Полімеразна ланцюгова реакція складається з трьох основних етапів: виділення ДНК із біопроби, безпосередньо ПЛР (ампліфікації) та реєстрації результатів за допомогою електрофорезу.

Реєстрація результатів ПЛР-аналізу. Першим етапом є розподіл продуктів ампліфікації методом горизонтального електрофорезу, другим – аналіз результатів електрофорезу, тобто читання електрофореграми. В усіх зразках повинна виявлятися смуга, відповідна за рухливістю внутрішньому контролю розміром 308 пар нуклеотидів, яка вказує на те що ампліфікація пройшла нормально. В позитивних контролях повинна виявлятися смуга розміром 501 пара нуклеотидів, а в негативних контролях смуга на рівні позитивного контролю повинна бути відсутня (поява смуги в негативному контролі свідчить про контамінацію компонентів набору).

В досліджуваних пробах відсутність смуги суто на рівні позитивного контролю свідчить про відсутність даного збудника в пробі (негативний результат). Наявність смуги, відповідної за електрофоретичною рухливістю позитивному контролю, вказує на наявність хламідії в даній пробі (позитивний результат).

Реакцію зв'язування комплементу проводили за загальноприйнятою методикою з застосуванням хламідійного і контрольного антигенів; хламідійної (позитивної) і контрольної (негативної) сироваток; комплементу; гемолізину; досліджуваних сироваток; 2, 5% суспензії еритроцитів барана.

Виділення та культивування хламідій на курячих ембріонах та білих мишах. Для зараження 6-7-денних курячих ембріонів (КЕ) та білих мишей із патологічного та клінічного матеріалу готували 10-20% суспензії на фізрозчині з шматочків головного мозку, легень та паренхіматозних органів аборт-плодів, загиблих та вимушено забитих тварин, сперми, тощо з додаванням стрептоміцину (0, 1 г/см3). Для наступних пасажів використовували 10% суспензії з біоптатів білих мишей та КЕ попереднього пасажу без додавання антибіотика, дотримуючись стерильності на усіх етапах роботи.

Курячі ембріони заражали в жовткові міхури, білих мишей – інтраназально, інтраперитоніально та інтрацеребрально.

Мікроскопічні дослідження. Для мікроскопічних досліджень на хламідіоз готували мазки з проб сперми, мазки-відбитки з тканин головного мозку, легень, селезінки, печінки та нирок аборт-плодів, загиблих або вимушено-забитих свиней та лабораторних білих мишей і з жовткових міхурів КЕ, на яких культивувались суспензії досліджуваних матеріалів, які забарвлювали за Стемпом. Також досліджувались гістологічні препарати тканин органів поросят-гнотобіотів при експериментальному