Застосування полімеразної ланцюгової реакції для діагностики хламідіозу свиней

 

 

Визначення рівня гомології нуклеотидних послідовностей гена, що кодує 16S рибосомальної РНК Сhlamydia trachomatis, Сhlamydia suis та Сhlamydiophila psittaci

Для застосування ПЛР в діагностиці хламідіозу свиней наш вибір зупинився на наборі реагентів для виявлення ДНК C. trachomatis “Полімік” НВФ “Літех”. Такий вибір зумовлений, перш за все, тим, що в указаному наборі підібрана система праймерів на ділянку гена, що кодує 16S рРНК, який є найбільш консервативним для усіх видів збудника хламідіозу. Цей факт був підтверджений шляхом порівняльного аналізу секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот гена, який кодує 16S рРНК C. trachomatis та C. suis і C. psittaci, оскільки саме C. suis і С. psittaci найчастіше виступають інфекційними чинниками хламідіозу свиней. Секвеновані послідовності вказаних нуклеїнових кислот одержані з бази даних Gen Bank (США).

Установлено, що на 1545 нуклеотидних послідовностей гена, який кодує 16S рРНК

C. suis, налічується 105 замін відносно цього гена C. trachomatis та C. psittaci (рис. 1), що свідчить про рівень гомології 93, 2%. Це вказує на те, що цей ген за своєю структурою дійсно є досить консервативним для різних видів збудника цього захворювання, і відповідно пара праймерів, підібрана на фрагмент цьго гена, з високим рівнем вірогідності є не лише специфічною суто для C. trachomatis, а також універсальною для інших видів збудника хламідіозу. А тому вказаний набір “Полімік” на наш погляд є цілком придатним для його використання для діагностики хламідіозу свиней.

Індикація збудника хламідіозу в препаратах біологічної промисловості методом полімеразної ланцюгової реакції

Окрім порівняльного аналізу секвенованих послідовностей гена трьох видів хламідій, що кодує 16S рибосомальної РНК, на який розроблена система праймерів в наборі “Полімік” для виявлення ДНК хламідій людини, виробництва НВФ “Літех”, нами була проведена робота по індикації хламідій в препаратах біологічної промисловості методом полімеразної ланцюгової реакції з використанням вказаного діагностикуму.

Ця робота проводилась з метою на експериментальному рівні довести або спростувати можливість використання набору реагентв “Полімік”, призначеного для діагностики хламідіозу людини, у ветеринарній практиці, оскільки досліджувані матеріали напевно містять збудники саме хламідіозу тварин чи орнітозу птахів, а не людини.

При дослідженні двох специфічних і двох контрольних орнітозних алергенів виявлено ДНК хламідій в обох специфічних при відсутності в контрольних, що свідчить про специфічність цього методу, а також набору реагентів “Полімік”. Термін постановки ПЛР і отримання результатів складав 4 – 4, 5 години.

Таким чином, результати досліджень специфічних та контрольних хламідійних антигенів для РЗК і орнітозних алергенів для внутрішньошкірної проби, в першу чергу, свідчать про те, що набори реагентів “Полімік”, призначені для діагностики хламідійних інфекцій людини методом ПЛР-аналізу, є придатними для виявлення хламідій в пробах від тварин і свиней зокрема. Ділянка гена, що кодує 16S рибосомальної РНК хламідії, на який підібрана система праймерів у вказаному наборі, дійсно є універсальною для різних видів збудника хламідіозу, а не суто специфічною для Сhlamydia trachomatis, оскільки досліджувані нами препарати біологічної промисловості напевно містили в собі ДНК хламідій тих видів, що викликають саме хламідіоз тварин.

Лабораторний дослід по експериментальному відтворенню хламідіозу свиней на поросятах-гнотобіотах

В даному досліді нами були використані 6 поросят-гнотобіотів, одержаних в умовах лабораторії гнотобіології і вірусології ПФІВМ УААН шляхом стерильної гістеротомії від свиноматки з господарства, благополучного за інфекційними хворобами свиней і хламідіозу зокрема.

Поросята були розділені на дослідну (n=4) і контрольну (n=2) групи в окремі стерильні бокси з оптимальним мікрокліматом (t 36°С, вологість повітря 50-55%).

Починаючи з восьмого дня життя, протягом чотирьох днів трьох поросят дослідної групи заражали супернатантом 10% суспензій, приготовлених з органів білих мишей та жовткових міхурів курячих ембріонів, на яких пасажували хламідії. Матеріал поросятам вводили раз на добу перорально в дозі 5 см3 та дворазово інтраназально в дозі 0, 5 см3 на кожну ніздрю. Четверте порося, яке не піддавали зараженню, утримувалось серед інфікованих (контактне).

Клінічний стан поросят дослідної та контрольної груп протягом досліду був у межах фізіологічної норми і не мав принципової різниці.

Дослідження сироваток крові поросят-гнотобіотів на хламідіоз методом РЗК як від поросят дослідної, так і контрольної груп дали негативні результати.

Не було виявлено і суттєвих змін на патологоанатомічних розтинах поросят, які виведені з досліду на 30 добу життя.

При проведенні патологогістологічних досліджень матеріалу інфікованих поросят-гнотобіотів спостерігали набряк мозкової тканини, потовщення стінок кровоносних судин та розширення навколосудинних просвітів головного мозку; розширення міжальвеолярних перетинок та потовщення стінок кровоносних судин легень, в той час як в тканинах селезінки, печінки та нирок усіх шістьох поросят, що використовувались в експерименті, ніяких змін виявлено не було.

В мазках-відбитках, приготовлених з тканин головного мозку трьох та з легеневої тканини одного поросяти-гнотобіота дослідної групи, які заражалися хламідійним матеріалом, було виявлено скупчення елементарних тілець (ЕТ).

Виявлено поодинокі включення ЕТ на мазках-відбитках, приготовлених з тканин головного мозку “контактного” поросяти-гнотобіота.

В мазках-відбитках з тканин головного мозку та легень поросят-гнотобіотів контрольної групи та з тканин селезінки, печінки та нирок усіх шістьох поросят ЕТ виявлено не було.

При зараженні лабораторних білих мишей та 6-7-добової інкубації курячих ембріонів, супернатантантом 10% суспензій матеріалу