Функціональні характеристики органної культури надниркових залоз при кріоконсервуванні та ксенотрансплантації

3. Оцінити стан адреналектомованих тварин після ксенотрансплантації їм кріоконсервованих культур з різною функціональною активністю на основі оцінки біохімічних і фізіологічних параметрів тварин, а також провести гістологічний і біохімічний аналізи трансплантатів.

Об'єкт дослідження – Вплив кріоконсервування і термінів низькотемпературного зберігання на морфофункціональні характеристики органної культури надниркових залоз новонароджених поросят.

Предмет дослідження – Кріоконсервована органна культура надниркових залоз новонародженоих поросят in vitro і при ксенотрансплантації.

Методи дослідження. У роботі використовувався метод органного культивування надниркових залоз, метод заморожування культури у присутності 5% димексиду, флуориметричний метод визначення 11-ОКС, спектрофотометричний метод визначення холестерину, колориметричний метод визначення білка для дослідження біохімічних параметрів, методи світлової мікроскопії для дослідження морфологічних характеристик нативної, кріоконсервованої ОКНЗНП, трансплантатів культури і надниркової залози щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. Представлено порівняльний аналіз зв'язку між станом адреналектомованих щурів після трансплантації їм кріоконсервованих органних культур наднирків новонародженого поросяти, що відрізняються рівнем базальної і стимульованої секреції. Уперше представлений гістологічний аналіз трансплантатів, що відрізняються за рівнем секретуючої здатності. Установлено, що трансплантовані культури розсисаються змішаним клітинно-ферментативним шляхом та шляхом організації. Навколо стимульованих екстрактом гіпофізу органних культур розвивається менше за силою демаркаційне запалення, ніж навколо нестимульованих. Установлено, що культура, оброблена стимулятором під час культивування, є більш чутливою до процесу кріоконсервування.

Практичне значення одержаних результатів. Органна культура надниркових залоз новонароджених поросят зберігає свої функціональні характеристики після 1-го року низькотемпературного зберігання. Термін життя кріоконсервованого ксенотрансплантату залежить від його функціонального стану до трансплантації. До 45-ої доби після трансплантації він характеризується наявністю секретуючих клітин, що мають здатність до стероїдогенезу і забезпечують підтримку рівня глюкокортикоїдів у адреналектомованих тварин на 80-87% в порівнянні з контрольними тваринами, що ще раз свідчить про придатність використання матеріалу в клінічних цілях. На основі оцінки факторів середовища, включаючи температуру, модифіковано флуориметричний метод визначення 11-ОКС, що дозволяє скоротити час і втрати глюкокортикоїдів при визначенні.

Особистий внесок здобувача. Винесені на захист положення і результати отримані дисертантом особисто. Роботи, що мають відношення до теми дисертації, опубліковані у співавторстві з Бондаренко Т. П. та іншими, відображають результати зі спільного планування і проведення експериментів, обговорення результатів і підготовки матеріалів до друку.

Автор самостійно провів аналіз отриманих результатів і зробив висновки в роботі.

Апробація результатів дисертації. Основні матеріали дисертаційної роботи доповідалися й обговорювалися на наукових конференціях молодих учених ІПКіК сумісно з кафедрою ЮНЕСКО у 2000 і 2001 роках, м. Харків; науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження акад. І. М. Буланкіна, 2001 рік, м. Харків; на конференції молодих учених: Медицина 3-го тисячоліття, 2001 рік, м. Харків; на 2-ому з'їзді трансплантологів України, 2001 рік, Київ; на Всеукраїнській науковій конференції «Успіхи і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини», 2001 рік, Харків; на науково-практичній конференції, присвяченій 150-річчю з дня народження академіка В. Я. Данилевського: «Патогенетичні аспекти фармакотерапії ендокринних захворювань», 2002 рік, Харків; на 35-му щорічному з'їзді Суспільства кріобіологів, 1998 рік, Пітсбург, США.

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 3 статті у фахових виданнях, 5 тез доповідей, видані методичні рекомендації.

Структура дисертації. Матеріали викладені на 180 стор. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, результатів власних досліджень та їхнього обговорення, заключення, висновків, списку використаних джерел, що нараховує 291, з яких 138 – вітчизняних джерел і 153 – іноземних. Робота ілюстрована 26 рисунками, 8 таблицями, 29 мікрофотографіями.

 

 

Матеріали і методи дослідження

В експериментах використовували органну культуру надниркових залоз, яку одержували з надниркових залоз новонароджених поросят (300 шт.), що доставляються з Агрокомплексу «Слобожанський» Харківської області, Чугуївського району, с. Граково, а також самці білих щурів вагою 150-170 г (210 шт.) у якості реципієнтів для трансплантації культури. Поросят забивали гільотинуванням з використанням легкого ефірного наркозу. Екстирпацію ендокринних органів здійснювали з дотриманням суворих правил асептики й антисептики. З тканин надниркової залози одержували органну культуру [Тронько Н. Д. 1988], вирощувану в середовищі на основі середовища 199 з 10% інактивованою телячою ембріональною сироваткою, антибіотиками: пеніцилін – 100 од/мл і канаміцин – 150 од/мл. Термін культивування – 5 діб.

Рівень глюкокортикоїдів визначали флуориметричним методом [Рєзников А. Г. 1980] у нашій модифікації [Бондаренко Т. П., Геращенко А. В. 2001], і розраховували на білок, що визначався за методом Бредфорда [Bradford M. M. 1976], або масу тканини. Інтенсивність флуоресценції вимірювали на флуориметрі Hitachi-MPF-2A при довжині хвилі збудження 470 нм і довжині хвилі випущення 525 нм. Як стимулятор стероїдогенезу використовували синтетичний аналог адренокортикотропного гормону (АКТГ) синактен (0. 2 Од/мл) і 10% екстракт гіпофіза (ЕГ), одержувані за методикою [Легач Е. И. 1998] у дозі 10 і 50 мкл на 1 мл ОКНЗНП і 1 мл середовища. У ряді окремих експериментів використовували інгібітор стимульованої секреції – хлорид кадмію (CdCl2) у концентрації 10-2 М. Здатність до стероїдогенезу визначали за здатністю культури утилізувати екзогенний холестерин, обумовлений спектрофотометрично дігітоніновим методом (Кейтс М. 1975). Заморожування здійснювали у присутності 5% димексиду за методом [Бондаренко Т. П., Легач Е. И. 1999] у поліетиленових ампулах по 10 мл. Після низькотемпературного зберігання при -196С (1-360 днів) робили відігрівання