Функціональні характеристики органної культури надниркових залоз при кріоконсервуванні та ксенотрансплантації

Двосторонню адреналектомію щурам здійснювали під ефірним наркозом за методикою (Кудряшов Б. А. 1984). Після адреналектомії тварини знаходилися в приміщенні при температурі 25-27C, а раціон уключав їжу, збіднену солями калію, і воду у вигляді 1% розчину хлористого натрію. Через 30 діб після операції тваринам здійснювалася ксенотрансплантація (КсТц) кріоконсервованої ОКНЗНП (КОКНЗНП). Терміни КсТц з'ясовані експериментально за розвитком гіпокортицизму у А/Е тварин (40 шт).

У першій серії експериментів експериментальні тварини були розбиті на групи (100 шт) : ложнооперовані (Л/О) тварини, Л/О тварини з КсТц КОКНЗНП без впливів, з інкубацією з 10 мкл ЕГ і 50 мкл ЕГ, адреналектомовані (А/Э), А/Е тварини з КсТц КОКНЗНП без впливів, з інкубацією з 10 мкл ЕГ і 50 мкл ЕГ.

В другій серії експериментів трансплантували рекультивовану протягом 1 доби КОКНЗНП. Експериментальні тварини були розбиті на групи (70 шт) : Л/О щури, А/Е щури, А/Е щури з КсТц рекультивованої КОКНЗНП без впливів, А/Е щури з КсТц рекультивованої КОКНЗНП, інкубованої з 10 мкл ЕГ, А/Е щури з КсТц рекультивованої КОКНЗНП, інкубованої з CdCl2 (10-2 М).

Тварин забивали через 30 діб після КсТц у першій серії експериментів і 45-ої доби в другій серії експериментів. Трансплантат брали на гістологічний і біохімічний аналізи. Аналізували зміст глюкокортикоїдів у плазмі крові експериментальних тварин, співвідношення мас внутрішніх органів до маси тіла тварини. У сім’яниках визначали рівень 11-ОКС. Надниркові залози Л/О щурів брали для визначення в них 11-ОКС та на гістологічний аналіз.

Матеріал для гістологічних досліджень фіксували 10% нейтральним формаліном і піддавали стандартній методиці заливання в парафін (Киселі Д. 1962). Зрізи офарблювали гематоксилін-еозіном (Киселі Д. 1962; Лилли Р. 1969), дослідження проводили під світловим мікроскопом зі збільшенням 1040 і 1090 (Шрейбер В. 1987). Мікрофотозйомку – за допомогою мікрофотонасадки МФНЕ-1У4. 2.

Статистичну обробку результатів здійснювали за методом Стьюдента-Фішера за допомогою пакета програм Ехсеl і SigmaPlot.

Результати досліджень та їхнє обговорення

На сьогоднішній день існує багато різновидів флуориметричного методу визначення глюкокортикоїдів, які відрізняються способом екстракції, що відбивається на кількості екстрагованого гормону і відтворюваності методу. При цій процедурі може відбуватися до 30-60% утрати гормонів. Для оптимізації флуориметричного методу визначення гормонів нами були проведені дослідження з вивчення впливу температури, часу й умов центрифугування на екстракцію гормонів.

Проведені дослідження дозволили нам зробити висновок про те, що кількість гормону, що екстрагується, і відтворюваність флуориметричного методу визначення глюкокортикоїдів залежать від температури, концентрації гормонів і часу контакту останніх з реагентами. Підвищення температури до 37С, концентрація гормонів шляхом вакуумного випарювання і термостатування з флуоресцентним реагентом (3 хв 60С, 3 хв 22 С) забезпечують відразу розвиток максимуму флуоресценції за 6 хв у порівнянні з 1. 5 годинами за стандартною методикою і дозволяють знизити втрати глюкокортикоїдів, підвищити відтворюваність. Усі наступні експериментальні дані, представлені в нашій роботі з визначення гормонів, були проведені на основі використання експериментальних умов, виявлених і описаних у цьому розділі роботи.

Заморожування ОКНЗНП у присутності 5% дімексиду дозволяє зберегти структурну цілісність адренокортикоцитів (Бондаренко Т. П., Легач Е. И. 1999). У своїй роботі ми використовували даний метод заморожування. Ми вважали за доцільне з'ясувати, чи відбуваються зміни функціональних характеристик ендокринного матеріалу при його тривалому зберіганні при -196С. У зв'язку з цим проведені дослідження з визначення після відігрівання секретуючої здатності КОКНЗНП, що зберігалася в різні терміни. Інкубація проводилася протягом 30 хв 37С при відсутності і присутності стимуляторів стероїдогенезу (n=10). Як стимулятори використовували синактен – синтетичний аналог адренокортикотропного гормону (АКТГ) й екстракт гіпофіза (ЕГ), що містить природний гормон.

Отримані результати представлені в табл. 1. Видно, що зберігання ендокринного матеріалу протягом 1 року не супроводжується зміною досліджуваних параметрів, що дозволило нам надалі використовувати КОКНЗНП для трансплантації А/Е тваринам. З даних табл. 1. випливає, що базальна секреція гормонів у заморожених зразках знаходиться на рівні 85% від контролю (Р<0. 05), а стимульована секреція зберігається на рівні контрольних зразків. Остання обставина є дуже важливою для випадків трансплантації зразків тваринам, оскільки трансплантант повинний підкорятися життєдіяльності організму. Відсутність розходжень у закономірностях відповіді базальної і стимульованої секреції гормонів нативним і кріоконсервованим матеріалом дозволяє припустити, що рецептори, відповідальні за взаємодію з АКТГ, не ушкоджуються. А відсутність видової специфічності АКТГ (Теппермен Дж., Теппермен Х. 1989) означає, що адренокортикоцити повинні реагувати на АКТГ будь-якого виду тварин.

Про стероїдогенез судили за рівнем споживання екзогенного холестерину. Зменшення холестерину і секреція гормонів знаходяться в еквімолярному відношенні 1: 1 [Розен В. Б. 1984, Теппермен Дж. 1989]. Тому, за зміною рівня холестерину можна побічно судити про стероїдогенез. Була оцінена сумарна, вільна і зв'язана фракції холестерину.

Зміни спостерігалися тільки в сумарній і вільній фракції, і ці зміни збігалися, що свідчило про те, що вільна фракція холестерину дійсно є“стероїдогенною”. Утилізація холестерину клітинами КОКНЗНП свідчила про те, що ми маємо справу дійсно з матеріалом, що функціонує, причому, хоча

 

Таблиця 1

Рівень секреції глюкокортикоїдів КОКНЗНП залежно від строків зберігання (-196С) 

 

Умови експерименту Вміст глюкокортикоїдів

нмоль/л мг тканини % від контр. %