Роль збуджуючих амінокислот і опіатних механізмів у розвитку резистентних форм епілептичного синдрому (експериментальне дослідження)

Підготовка зрізів гіпокампа і дослідження популяційної активності пірамідних нейронів. Після декапітації тварин обидві половинки гіпокампа швидко розміщали в чашці Петрі з охолодженим до +5 оС розчином такого складу (у мМ на літр) : NаCl-125; NaHСО3-26; КСl-5; МgCl2-3; глюкоза-20. Зрізи завтовшки 300-600 мкм нарізали тонким лезом, постійно зволожуючи поверхню гіпокампа. Протягом реєстрації електрофізіологічних показників здійснювали перфузію камери розчином такого складу (у мМ на літр) : NаCl-135; NaHСО3-18; КСl-2, 7; МgCl2-1, 5; глюкоза-20 (рН 7, 35-7, 4). Розчини постійно насичували газовою сумішшю СО2 (95%) і О2 (5%)  (М. І. Мітюшов, 1985). Повна заміна інкубаційного середовища в камері здійснювалася протягом 4 хв.

Колатералі Шаффера стимулювали парними прямокутними електричними імпульсами (тривалість 50 мкс, інтервали між імпульсами 10 і 100 мс) за допомогою біполярних електродів, виготовлених з ніхромового дроту. Джерелом електричних стимулів був електростимулятор ЕСУ-2.

Перша серія вимірювань здійснювалася в умовах інкубації зрізів гіпокампа без додавання препаратів, після чого в середовище додавали DAMGО (300 нМ) і проводили другу серію стимуляцій протягом 20 хв. Потім в інкубаційне середовище вводили NMDA (1, 0 мкМ) і протягом 60 хв здійснювали стимуляції; через 20 і 40 хв від моменту введення препарату реєстрували відповідні зміни. Для кількісної оцінки ефекту від введення препаратів визначали відносну зміну амплітуди 10 послідовно усереднених популяційних спайків (Q) за формулою (V. Armand et al., 1999) :

 

Q = (АО- АК) /АК х 100%,

 

де АО – амплітуда спайка в досліджуваній серії (при додаванні в інкубаційне середовище препаратів), АК – амплітуда спайків до моменту додавання препаратів в інкубаційне середовище.

Комп'ютерну обробку (запис і аналіз електричних процесів) здійснювали за допомогою АЦП LаbPC+ (“Nаtіоnаl Instruments”, США) та оригінальної програми, розробленої за допомогою пакету LabView.

Всі отримані результати обробляли за допомогою загальноприйнятих у медико-біологічних дослідженнях параметричних і непараметричних методів статистичного аналізу. Для дослідження характеру взаємодії препаратів застосовували ізоболографічну методику (De Jоghn, 1961; R. F. Wallin et al., 1970). Статистичну обробку здійснювали на персональному комп'ютері за допомогою програми статистичного аналізу “SigmaStat” (“Jandel Scientific”, 1994). Критерієм достовірності обирали P<0, 05.

 

 

1. Ефекти DAMGО, динорфіну А1-13 і DADLE на судорожну активність, викликану ЕС мигдалика у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу. Введення DАМGО (10 нмоль, в/шл) супроводжувалося скороченням латентного періоду виникнення судорог (P<0, 01) і полегшенням розвитку судорог тяжкістю 5 балів. Локальне введення DАМGО у вентральний гіпокамп викликало доза-залежне збільшення тяжкості судорог дозами 5 і 10 нмоль (P<0, 05). Введення динорфіну А1-13 і DADLE (10, 0 нмоль, в/шл) супроводжувалося збільшенням латентного періоду перших судорог і запобігало розвитку генералізованих судорожних реакцій. Введення в гіпокамп динорфіну А1-13 і DADLE викликало зниження тяжкості судорог при застосуванні всіх доз (2, 5; 5 і 10 нмоль)  (P<0, 05). Внутрішньонігральне застосування DАМGО збільшувало тяжкість судорог при введенні дози 10, 0 нмоль і зменшувало латентний період перших судорог при всіх трьох дозах (P<0, 01). За цих умов динорфін А1-13 дозами 5, 0 і 10, 0 нмоль зменшував тяжкість судорог і збільшував їх латентний період (P<0, 01). Внутрішньонігральне введення DADLE супроводжувалося розвитком доза-залежного протисудорожного ефекту при дозах 5, 0 і 10, 0 нмоль (P<0, 05). Таким чином, стимуляція активності -опіатних рецепторів (DAMGО) у віддаленому періоді ЕС-кіндлінгу супроводжується полегшенням епілептогенезу, тимчасом як стимуляція -опіатних рецепторів (динорфін А1-13) і, меншою мірою, -опіатних рецепторів (DADLE) супроводжується протисудорожним ефектом.

2. Вплив DAMGО, динорфіну А1-13 і DADLE на судорожну активність, викликану агоністами збуджуючих амінокислот у інтактних і кіндлінгових тварин.

Ефекти DAMGО. Введення КК в/шл у віддаленому періоді кіндлінгу на фоні попереднього застосування DAMGО (10, 0 нмоль, в/шл) дозою 0, 1 мкг викликало ТЕПК у 30% кіндлінгових щурів, а дозою 1, 0 мкг – у 80%. Середньоефективна доза епілептогену (ED50) становила 0, 39±0, 04 мкг, що було на 74, 2% менше за ED50, визначену в групі тварин у віддаленому періоді кіндлінгу без введення DAMGО. В цих умовах ED50 КК, що викликає КС, склала 0, 15±0, 02 мкг, що було на 25, 0% менше за аналогічний показник у кіндлінгових тварин без застосування DAMGO.

На фоні в/шл введення DАМGО (5, 0 нмоль) у віддаленому періоді кіндлінгу КК дозою 0, 6 мкг в/шл викликала КС, латентний період яких був менший, ніж такий у контролі, на 27, 0% (P<0, 05). В цих умовах тяжкість судорог склала 3, 4±0, 1 бали і була на 17, 0% більшою, ніж у тварин контрольної групи (P<0, 05)  (рис. 1). Застосування більших доз DАМGО призводило до скорочення латентного періоду перших судорожних реакцій, який у всіх випадках був меншим за аналогічний контрольний показник (P<0, 05). Також спостерігалося значне зростання інтенсивності судорожних реакцій і при введенні DАМGО максимальною дозою (50, 0 нмоль) – у всіх щурів реєструвалися повторні генералізовані судороги з летальним результатом (P<0, 05).

Застосування