Вплив блокаторів ліпоксигеназ та екзогенних лейкотриєнів В4 та С4 на апоптоз і некроз гепатоцитів щурів у первинній культурі

Теоретичне і практичне значення роботи. Результати дослідження мають фундаментальне значення для з'ясування механізмів регуляції апоптичної та некротичної загибелі клітин та обгрунтування необхідності диференційованого вивчення некротичної і апоптичної загибелі клітин в складних випадках захворювань печінки. В практичному аспекті одержані дані можуть бути важливими для розуміння ролі ліпоксигеназних похідних АК у розвитку патологічних станів печінки та обгрунтування методів їх корекції за допомогою використання специфічних блокаторів метаболізму АК.

Особистий внесок здобувача. При виконанні роботи здобувачем проведені науковий пошук і обгрунтування вибраного напрямку досліджень. Виконані експерименти по вивченню впливу блокаторів ліпоксигеназного шляху метаболізму АК, екзогенних лейкотриєнів В4 і С4 (окремо, і за умов блокади синтезу ендогенних ліпоксигеназних похідних АК). Проведено аналіз одержаних результатів, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень. Експериментальна робота по одержанню і культивуванню гепатоцитів проведена спільно з співробітниками відділу імунології та цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідалися на ХV з'їзді українського фізіологічного товариства (Донецьк, 12-15 травня 1998 р.), на пленумі товариства патофізіологів України (Чернівці, 20-22 травня 1998 р.), на ІІІ національному конгресі патофізіологів України з міжнародною участю (Одесса, 2000), на міжгалузевій конференції молодих вчених-2001 (Київ, 22 травня, 2001), на XVI з'їзді Українського фізіологічного товариства (м. Вінниця, 28-31 травня, 2002).

Публікації. Результати дисертації викладені в 11 публікаціях: статті – 5, тези конференцій, сімпозіумів, з'їздів, пленумів – 6.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 122 сторінках друкованого тексту та ілюстрована 34 рисунками та фотографіями. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу описання матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, розділу аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел. Список літератури охоплює 174 джерела.

 

 

Матеріали та методи досліджень. Об'єктом дослідження була первинна культура гепатоцитів. Для отримання гепатоцитів були використані дорослі самці щурів лінії Вістар масою 170-180 г. Виділення гепатоцитів проводили за методом Сеглена (1976). Тварин наркотизували нембуталом (40 мг/кг) та вводили гепарин (100 од.) у хвостову вену. Далі здійснювали перфузію ізольованої печінки через нижню порожнисту вену спочатку безкальцієвим розчином Хенкса, після чого продовжували перфузію розчином колагенази. Після виділення гепатоцити додатково очищали центрифугуванням в дискретному градієнті густини перколу.

Культивування клітин проводили в оброблених колагеном планшетах для культур клітин (“Sigma”, США) у поживному середовищі RPMI 1640, що містило 15 ммоль/л HEPES, 10% ембріональною телячою сироваткою та антибіотики. Густина клітин становила 1ґ105 на лунку. Через 3 год після посадки гепатоцити відмивали шляхом заміни середовища. Після 18 год культивування при 37оС у вологій камері з 5% СО2 клітини відмивали, замінювали середовище інкубації на середовище RPMI 1640 без ембріональної телячої сироватки та продовжували культивування клітин за експериментальних умов протягом різних проміжків часу. Нордигідрогуаяретову кислоту (НДГК, “Sigma”, США) та кофейну кислоту (КК, “Sigma”, США) додавали до кінцевої концентрації 10-6 та 2*10-5 моль/л. Лейкотриєни В4 або С4 (“Sigma”, США) вносили в культуральне середовище до кінцевої концентрації в діапазоні 10-7 – 10-12 моль/л. З метою вивчення впливу лейкотриєнів на гепатоцити у присутності блокаторів ліпоксигеназ в культуральне середовище вносили лейкотриєни В4 або С4 в концентраціях 10-8 моль/л через 15 хв після додавання блокаторів (у концентрації 2*10-5моль/л).

Активність аланінамінотрансферази (АЛТ) у культуральному середовищі визначали колориметричним методом в мікромодифікації [Коровкін Б. Ф., 1965].

Активність електрон-транспортного ланцюга (ЕТЛ) мітохондрій гепатоцитів визначали за допомогою МТТ-тесту [Reichner J. et al., 1995].

Культури клітин прижиттєво забарвлювали розчином ядерних барвників Хехсту 33342 і пропідіум йодиду, що дало можливість диференціювати живі, некротичні та апоптичні клітини. Барвник Хехст 33342 проникає крізь мембрани як живих, так і мертвих клітин та забарвлює ядра в зелений колір. Пропідіум йодид проникає крізь мембрани лише мертвих клітин і забарвлює ядра в оранжевий колір. Ядра апоптичних клітин переважно мають зелене забарвлення, містять конденсований та фрагментований хроматин, чи утворюють так звані апоптичні тільця. Підрахунок живих, некротичних і апоптичних клітин здійснювали за допомогою люмінесцентного мікроскопа (МЛ-2)  (х40). В кожному експерименті оцінювали стан не менш ніж 600 клітин.

Для електронно-мікроскопічних досліджень гепатоцити культивували в оброблених колагеном 8-лункових планшетах. Препарати готували за загальноприйнятою методикою. Ультратонкі зрізи (40-50 нм) контрастували і вивчали на електронному мікроскопі JEM 100 – CX (Jeol, Японія).

Представлені дані є результатом трьох-шести окремих експериментів для кожного показника. В кожному експерименті вплив досліджуваних речовин здійснювали паралельно в триплікатах культур клітин. Статистична обробка матеріалу проведена з обчисленням критерію t Стьюдента для пар даних [Ойвин И., 1960].

 

 

Адекватною експериментальною моделлю для дослідження впливу екзогенних лейкотриєнів і блокаторів ліпоксигеназ на життєздатність гепатоцитів є первинна їх культура, оскільки ця модель дозволяє вивчити ефекти, не опосередковані нейтрофілами, судинними реакціями та іншими процесами, що відбуваються на органному і організменному