Вплив блокаторів ліпоксигеназ та екзогенних лейкотриєнів В4 та С4 на апоптоз і некроз гепатоцитів щурів у первинній культурі

Електронно-мікроскопічне дослідження підтвердило, що за умов ведення первинної культури гепатоцитів, у присутності блокаторів ліпоксигеназ протягом 4 і 24 годин, виявлялася значна кількісті клітин з типовими для апоптозу морфологічними змінами ядра – значною конденсацією хроматину, зміною форми ядра та його фрагментацією. На поверхні клітин спостерігалися вип'ячування плазматичної мембрани, характерні для апоптозу. Клітини округлювались, міжклітинні контакти руйнувались, утворювались апоптичні тільця. Виявлялися також гепатоцити, що повністю розпались на апоптичні тільця. В окремих клітинах, поряд з типовими ознаками апоптозу (конденсація хроматину) спостерігали ознаки некрозу – порушення цілісності ядерної та плазматичної мембран, набухання мітохондрій. Ці спостереження свідчать на користь концепції некро-апоптозу [Lemasters J. J., 1999; Pieper A. et al., 1999], згідно якої апоптоз і некроз є крайніми проявленнями широкого спектру проміжних форм загибелі клітин.

Вплив екзогенних лейкотриєнів В4 та С4 на апоптоз і некроз у первинній культурі гепатоцитів. Відомо, що лейкотриєни (ЛТ) циркулюють у крові щурів у концентраціях порядка 10-12моль/л, а впливають на метаболічні процеси – у наномолярних концентраціях (10-9моль/л) [Iwai M., Jungermann K, 1988]. З метою дослідження дозозалежності ефектів ЛТ В4 та С4, а також їх можливої токсичної дії на гепатоцити, визначали активність АЛТ у культуральному середовищі за умов інкубації гепатоцитів у присутності ЛТ у кінцевих концентраціях: 10-7, 10-8, 10-10 та 10-12моль/л. Показано, що через 30 хв після додавання ЛТ в усіх застосованих концентраціях спостерігалось збільшення виходу ферменту АЛТ з культивованих гепатоцитів, що свідчить про посилення некротичних процесів (табл. 1). Таким чином, екзогенні ЛТ В4 та С4 в широкому діапазоні концентрацій від 10-7 до 10-12 моль/л викликають швидке збільшення виходу цитозольного ферменту АЛТ у культуральне середовище, що свідчить про високу чутливість гепатоцитів до дії ЛТ. Виявлений ефект є короткочасним, оскільки через 4 і 24 год після додавання ЛТ активність АЛТ у культуральному середовищі гепатоцитів, вірогідно не змінювалась порівняно з контролем.

При дослідженні впливу екзогенних ЛТ В4 і ЛТ С4 на активність ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів у первинній культурі було виявлено невеликі, але вірогідні зміни через 4 год після додавання ЛТ у концентраціях 10-7 та 10-8 моль/л. Так, ЛТ В4 у концентрації 10-7 моль/л пригнічував активність ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів на 15, 5% (Р<0, 05), а в концентрації 10-8 моль/л – на 14, 5% (Р<0, 05) відносно контролю. ЛТ С4 також зменшував цей показник – на 8% (Р<0, 05) та 12% (Р<0, 05) відповідно, хоча й в меншій мірі ніж ЛТ В4. Через одну та 24 год дослідження після додавання ЛТ у культуральне середовище не виявлено змін активності ЕТЛ мітохондрій гепатоцитів.

З метою дослідження впливу ЛТ на морфологічний стан гепатоцитів використовували екзогенні ЛТ В4 і С4 у концентрації 10-8 моль/л, за якої посилювався вихід АЛТ з гепатоцитів та пригнічувалась активність ЕТЛ мітохондрій. Показано вірогідне зменшення кількості живих клітин і збільшення кількості некротичних клітин через 1 год після додавання ЛТ В4 та ЛТ С4. Так, у присутності ЛТ В4 кількість живих клітин зменшувалась на 9, 3% (Р<0, 05), а кількість некротичних клітин збільшувалась на 9, 2% (Р<0, 05) відносно контролю через 1 год після впливу. У присутності ЛТ С4 також кількість живих клітин зменшувалась на 7, 7% (Р<0, 05), а некротичних збільшувалась на 7, 3% (Р<0, 05) відносно контролю. Через 24 год культивування у присутності ЛТ не виявлено вірогідних змін життєздатності клітин. Обидва ЛТ не викликали суттєвих змін кількості апоптичних клітин в дослідженні строки. Таким чином, екзогенні ЛТ В4 і С4 викликають вірогідне зменшення кількості живих клітин і збільшення кількості некротичних клітин через 1 год культивування, але суттєво не змінюють кількість апоптичних клітин.

Електронно-мікроскопічні дослідження гепатоцитів, культивованих у присутності екзогенних ЛТ В4 і С4 протягом 1 та 24 год, також показали істотне збільшення кількості клітин з типовими рисами некрозу. Було виявлено клітини на початкових стадіях некрозу, для яких характерне просвітлення цитоплазми, формування вакуолей, набухання та просвітлення матриксу мітохондрій та їх вакуолізація, просвітлення та гомогенізація вмісту ядра; при цьому ядерна мембрана зберігала свою цілістність. Спостерігалась значна кількість клітин на кінцевих стадіях некрозу, а саме: з великою кількістю вакуолей, деструкцією мітохондрій, порушенням цілістності ядерної та плазматичної мембран, та, як наслідок, вимиванням вмісту ядра. Таким чином, сукупність отриманих даних за показниками виходу АЛТ з гепатоцитів, функціональної активності мітохондрій, кількості живих і некротичних клітин та ультраструктурних змін свідчить про ушкоджуючий вплив ЛТ на гепатоцити. Ці дані підтверджують уявлення про патогенетичну роль ЛТ в ураженні паренхіми печінки при збільшенні їх концентрації в умовах патології. Можливе пояснення механізмів дії продуктів ліпоксигенази та їх блокаторів дає концепція некроапоптозу [Pieper A. et al., 1999; Lemaster J. J., 1999]. Згідно цієї концепції, запускати процеси некрозу або апоптозу можуть одні й ті ж сигнали, але той чи інший напрямок загибелі клітини залежить від її життєвого і функціонального стану. Наприклад, утворення мітохондріальних пор розглядається як механізм розвитку як некрозу, так і апоптозу. Якщо утворення мітохондріальних пор призводить до виснаження енергетичного запасу