Вплив блокаторів ліпоксигеназ та екзогенних лейкотриєнів В4 та С4 на апоптоз і некроз гепатоцитів щурів у первинній культурі

8. Alexeyeva I., Makogon N., Lushnikova I., Korneitchuk A. The influence of arachidonic acid metabolism inhibitors on some functions of normal and carbon tetrachloride-injured rat hepatocytes culrured alone and with Kupffer cells // XIIIth International Congress of Pharmacology (Munchen, 26-31 July, 1998).

9. Макогон Н. В., Алексєєва І. М., Лушнікова І. В., Корнійчук Г. М. Вплив лейкотриєнів В4 та С4 на гепатоцити щурів в культурі // ІІІ Національний конгрес патофізіологів України з міжнародною участю (Одесса, 2000), Фізіол. журн. -2000. -Том 46, №2. -С. 89.

10. Корнійчук Г. М., Макогон Н. В., Лушнікова І. В., Алексєєва І. М. Блокатори ліпоксигеназ індукують апоптоз гепатоцитів щурів в первинній культурі // Міжгалузева Конференція молодих вчених-2001 (Київ, 22 травня, 2001).

11. Алексєєва І. М., Корнійчук Г. М., Макогон Н. В., Лушнікова І. В. Роль ліпоксигеназного шляху метаболізму арахідонової кислоти в регуляції апоптозу гепатоцитів щурів в первинній культурі // XVI З'їзд фізіологів (Вінниця, травень 2002 р.)

 

Корнійчук Г. М. Вплив блокаторів ліпоксигеназ та екзогенних лейкотриєнів В4 і С4 на апоптоз і некроз гепатоцитів щурів у первинній культурі. – Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 13 – фізіологія людини і тварин – Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України, Київ, 2002 р.

Вивчення регуляторної та патогенетичної ролі похідних арахідонової кислоти за ліпоксигеназним шляхом її метаболізму в загибелі клітин є однією з актуальних проблем фізіології та патофізіології. В даній роботі показано, що загальний блокатор ліпоксигеназ – нордигідрогуаяретова кислота і блокатор 5-ліпоксигенази – кофейна кислота в концентрації 2*10-5моль/л зменшують некроз і індукують апоптоз гепатоцитів у первинній культурі (за даними активності аланінамінотрансферази у культуральному середовищі, прижиттєвого подвійного забарвлення клітин ядерними барвниками Хехстом 33342 і пропідіум йодидом та електронно-мікроскопічного дослідження). При цьому спостерігається підвищення активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів (за даними МТТ-тесту). Більш ефективною була дія загального блокатора, що вказує на участь в цих процесах не лише 5-ліпоксигенази, а й інших ліпоксигеназ. При додаванні екзогенних лейкотриєнів (ЛТ) В4 або С4 в широкому діапазоні кінцевих концентрацій від 10-7 до 10-12 моль/л показано посилення некрозу гепатоцитів у первинній культурі. Пронекротична дія ЛТ супроводжувалась пригніченням активності електрон-транспортного ланцюга мітохондрій гепатоцитів. Пронекротичний ефект ЛТ за умов дії блокаторів ліпоксигеназ був подібним до ефекту ЛТ окремо, однак дещо більш вираженим. В той же час, ЛТ В4 і С4 істотно знижували апоптоз, індукований блокаторами ліпоксигеназ.

Отримані результати свідчать, що ліпоксигеназний шлях метаболізму арахідонової кислоти є важливим регулятором життєздатності і загибелі гепатоцитів. Блокатори ліпоксигеназ індукують апоптоз і зменшують некроз гепатоцитів, а ліпоксигеназні похідні арахідонової кислоти, зокрема ЛТ В4 і С4, зміщують співвідношення апоптичної та некротичної загибелі клітин в бік останнього. Одним з механізмів посилення апоптичних процесів може бути підвищення функціональної активності мітохондрій, а посилення некротичного шляху загибелі клітин – пригнічення їх функцій.

Ключові слова: гепатоцити, апоптоз, некроз, ліпоксигенази, нордигідрогуаяретова кислота, кофейна кислота, лейкотриєни, активність аланінамінотрансферази, активність електрон-транспортного ланцюга мітохондрій, подвійне забарвлення ядер клітин, електронна мікроскопія.

 

Корнийчук А. Н. Влияние блокаторов липоксигеназ и экзогенних лейкотриенов В4 и С4 на апоптоз и некроз гепатоцитов крыс в первичной культуре. – Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 13 – физиология человека и животных – Институт физиологии им. А. А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2002 г.

Два варианта гибели клеток – апоптоз и некроз – в разных соотношениях наблюдаются при патологии печени. Важным является изучение регуляции этих процессов с целью возможного на них влияния. Есть данные о том, что продукты липоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты участвуют в регуляции апоптической гибели некоторых типов клеток. Их роль в процессах гибели гепатоцитов практически не изучена. В данной работе изучали влияние экзогенных лейкотриенов (ЛТ) В4 и С4, а также блокаторов липоксигеназ на апоптоз и некроз гепатоцитов крыс в первичной культуре.

Адекватной экспериментальной моделью для изучения непосредственного действия экзогенных лейкотриенов и блокаторов липоксигеназ на апоптическую и некротическую гибель клеток является первичная культура гепатоцитов, поскольку эта модель позволяет изучить их прямой эффект на гепатоциты, не опосредованный нейтрофилами, сосудистыми реакциями и другими процессами, происходящими на органном и организменном уровнях. Для изучения участия липоксигеназних продуктов метаболизма арахидоновой кислоты в некротической и апоптической гибели гепатоцитов в данной работе использовали фармакологический подход с применением обшего блокатора липоксигеназ – нордигидрогуаяретовой кислоты (НДГК) и блокатора 5-липоксигеназы – кофейной кислоты (КК), а также экзогенных ЛТ В4 и С4, продуктов 5-липоксигеназы, в норме и в условиях блокады эндогенных липоксигеназ гепатоцитов.

Показано, что общий блокатор липоксигеназ – НДГК и блокатор 5-липоксигеназы – КК в концентрации 2*10-5моль/л уменьшают некроз и индуцируют апоптоз гепатоцитов в первичной культуре (по данным активности цитозольного фермента аланинаминотрансферазы (АЛТ) в культуральной среде, двойного прижизненного окрашивания клеток ядерными красителями Хехстом 33342 и пропидиум иодидом, электронно-микроскопического исследования). При этом наблюдалось повышение активности электрон-транспортной цепи (ЕТЦ) митохондрий гепатоцитов (по данным МТТ-теста). Более эффективным было действие общего блокатора, что указывает на участие в этих процессах не только 5-липоксигеназы, но и других липоксигеназ. При внесении экзогенных ЛТ В4 или С4 в диапазоне конечных концентрацый от 10-7 до 10-12 моль/л показано усиление некроза гепатоцитов в первичной культуре. Пронекротическое действие ЛТ сопровождалось угнетением активности ЕТЦ митохондрий гепатоцитов. Пронекротический эффект ЛТ в условиях действия блокаторов липоксигеназ был подобным эффекту ЛТ отдельно, однако более выраженным. В тоже время, ЛТ В4 и С4 существенно снижали апоптоз, индуцированный блокаторами липоксигеназ.

Полученные данные свидетельствуют, что липоксигеназний путь метаболизма арахидоновой кислоты является важным регулятором жизнеспособности и гибели гепатоцитов. Блокаторы липоксигеназ индуцируют апоптоз и уменьшают некроз гепатоцитов, а липоксигеназные производные арахидоновой кислоты, в частности ЛТ В4 и С4, смещают соотношение апоптической и некротической гибели клеток в сторону последнего. Одним из механизмов изменения соотношения апоптоза и некроза клеток может быть изменение функциональной активности митохондрий.

Ключевые слова: гепатоциты, апоптоз, некроз, липоксигеназы, нордигидрогуаяретовая кислота, кофейная кислота, лейкотриены, активность аланинаминотрансферазы, активность електрон-транспортной цепи митохондрий, двойное прижизненное окрашивание ядер клеток, электронная микроскопия.

 

Korniychuk G. M. The influence of lipoxygenase inhibitors and exogenous leukotrienes B4 and C4 on apoptosis and necrosis in rat cultured hepatocytes.

Thesis for a candidate's degree on speciality 03. 00. 13 – human and animal physiology – Bogomoletz Institute of Physiology of the NAS of Ukraine, Kyiv, 2002.

 

Study of the regulatory and pathogenic role of lipoxygenase metabolites of arachidonic acid in cell death is important problem of physiology and pathophysiology. This investigation has demonstrated that a general lipoxygenase inhibitor (nordihydroguaiaretic acid) and a 5-lipoxygenase inhibitor (caffeic acid) at concentration of 2*10-5 M decreased necrosis and induced apoptosis in rat hepatocyte in the primary cultures (studied by activity of alamine aminotransferase in the cultural medium, by fluorescent light microscopy after double cells staining with Hoechst 33342 and propidium iodide, and by electron microscopy). An increase in mitochondrial electron transport chain activity in cultured hepatocytes also was observed (by MTT test) under inhibitor treatment. General inhibitor has demonstrated to exert a stronger apotopsis-inducing effect than 5-lipoxygenase inhibitor. It allows us to suggest that not only 5-lipoxygenase, but also other lipoxygenases participate in these processes. Exogenous leukotrienes (LT) B4 or C4 in a wide range of concentrations (from 10-7 to 10-12 M) caused an increase of necrosis in hepatocytes. Necrosis-inducing effect of LT was accompanied by depression of the mitochondrical electron transport chain activity in hepatocytes. Necrosis inducing effect of LT on hepatocytes treated with lipoxygenase inhibitors tended to be the same as the LT effect on untreated cells, however it was more pronounced. At the same time, LTB4 and LTC4 significantly decreased apoptosis induced by lipoxygenase inhibitors.

The results of the research suggest that lipoxygenase pathway of arachidonic acid metabolism is an important regulator of hepatocyte viability and death. Lipoxygenase inhibitors induce apoptosis and reduce hepatocyte necrosis, while lipoxygenase-derived arachidonic acid metabolites, in particular LT B4 and LT C4, move the ratio of the apoptotic and necrotic death towards the latter. One of the possible mechanisms underlying apoptos-inducing effect of lipoxygenase inhibitors may be the increase of mitochondrial functional activity; on the other hand, depression of mitochondrial functions under LT treatmens may be a couse for enhencing of hepatocyte necrosis.

Key words: hepatocyte, apoptos, necros, lipoxygenase, nordihydroguaiaretic acid, caffeic acid, leukotrienes, activity of alamine aminotransferase, mitochondrial electron transport chain activity, double cells staining, electron microscopy.