Вплив блокаторів ліпоксигеназ та екзогенних лейкотриєнів В4 та С4 на апоптоз і некроз гепатоцитів щурів у первинній культурі

Морфологічна оцінка суспензії гепатоцитів, що були використані для одержання первинної культури, показала, що клітини мали високий ступінь життєздатності і чистоти. Кількість живих гепатоцитів в суспензіїї перед їх посадкою становила 93, 8±1, 0%, вміст непаренхіматозних клітин – біля 6%. Через 3 год після посадки у планшети для культивування клітини прикріплялися до колагенового субстрату. Через 18 год після посадки первинна культура гепатоцитів мала вигляд моношару полігональних клітин, яку можна віднести до культур високої щільності.

Вплив загального блокатора ліпоксигеназ – нордигідрогуаяретової кислоти та блокатора 5-ліпоксигенази – кофейної кислоти на апоптоз і некроз гепатоцитів у первинній культурі. Оскільки проявлення активності цитозольного ферменту гепатоцитів аланінамінотрансферази (АЛТ) у культуральному середовищі є наслідком його виходу з клітин внаслідок ушкодження плазматичної мембрани, вивчення активності АЛТ дає можливість оцінити некротичні процеси в гепатоцитах. За умови культивування гепатоцитів у присутності блокаторів ліпоксигеназ – нордигідрогуаяретової кислоти (НДГК) та кофейної кислоти (КК) в концентрації 2*10-5 моль/л спостерігалось зниження активності АЛТ у середовищі інкубації гепатоцитів. Більш значним був вплив загального блокатора ліпоксигеназ – у присутності НДГК активність АЛТ у культуральному середовищі була нижчою на 48% (Р<0, 001), 18% (Р<0, 05) та 23% (Р<0, 01) порівняно з контрольною культурою через 1, 4 та 24 год культивування відповідно. Дія КК була однонаправленою з дією НДГК, хоча і менш вираженою – активність АЛТ у культуральному середовищі знижувалась на 18% (Р<0, 05) через 4 години після впливу. Отримані дані свідчать, що у присутності блокаторів ліпоксигеназ спостерігається зменшення виходу цитозольного ферменту АЛТ з гепатоцитів у культуральне середовище на протязі 24 год культивування, що може вказувати на зменшення некротичного ушкодження мембран гепатоцитів. Зменшення показника було більш виражене при дії НДГК, яка є блокатором 5-, 12- і 15-ліпоксигеназ, ніж при дії блокатора 5-ліпоксигенази – КК, що свідчить про участь у підтриманні життєздатності гепатоцитів не тільки 5-ліпоксигенази, а й інших ліпоксигеназ. Наші результати співпадають з даними інших авторів, одержаних переважно in vivo та на перфузованій печінці. Так було показано, що блокада ліпоксигеназ діетилкарбамазином, кофейною кислотою, АА-864 та НДГК призводила до суттєвого зменшення ушкодження печінки in vivo, викликанного ССL4, ішемією-реперфузією та іншими впливами [Meng X., Wang J., 1994; Gonzalez R. et al, 1994; Reyes M. et al, 1995]. При цьому знижувався рівень активності АЛТ, аспартатамінотрансферази, лактатдегідрогенази та лужної фосфатази в сироватці крові, тобто блокада ліпоксигеназ запобігала порушенню цілісності плазматичних мембран гепатицитів та їх цитолізу.

Застосування МТТ-тесту дозволило оцінити активність електрон-транспортного ланцюга (ЕТЛ) мітохондрій – інтегральний показник фізіологічного стану живих клітин. За умов додавання НДГК у середовище інкубації зміни активності ЕТЛ гепатоцитів мали фазний характер. Через 1 год спостерігалось підвищення активності ЕТЛ на 26% (Р<0, 01) порівняно з контролем. Через 24 год відмічено зменшення цього показника на 21% (Р<0, 05). За умов дії КК також виявлено підвищення активності ЕТЛ мітохондрій через 1 год на 15% (Р<0, 05). Однак через 24 год після додавання КК, на відміну від НДГК, спостерігалось вірогідне підвищення цього показника на 11% (Р<0, 05) порівняно з контролем. Таким чином, у ранній термін культивування виявлена однонаправленість впливу блокаторів ліпоксигеназ на ЕТЛ, а саме підвищення його активності. Це може свідчити про негативний регуляторний вплив продуктів ліпоксигеназ на функціональну активність мітохондрій. Ефект НДГК був більш вираженим, тобто в змінах активності ЕТЛ мітохондрій, можливо, приймають участь не тільки 5-ліпоксигеназа, а й інші ліпоксигенази. Механізм такого ефекту блокаторів ліпоксигеназ може бути частково пов'язаний з порушенням гомеостазу активних кисневих метаболітів, а також з негативно спрямованим впливом продуктів ліпоксигеназ на мітохондрії. Крім того, однією з можливих причин зміни показника МТТ-тесту (зменшення активності ЕТЛ) є загибель клітин у первинній культурі.

Аналіз впливу НДГК на життєздатність гепатоцитів у первинній культурі за показниками АЛТ і МТТ-тесту привів нас до припущення, що протягом 24 годинного терміну може мати місце загибель гепатоцитів (спостерігали зменшення активності ЕТЛ мітохондрій), але не за рахунок некрозу (оскільки не відбувалось збільшення виходу АЛТ з клітин), а за рахунок апоптозу, що і стало предметом подальшого дослідження. Це припущення базується також на встановленій останнім часом ролі ліпоксигеназних похідних АК як важливих регуляторів виживання та апоптозу клітин. Так, показано, що НДГК індукувала апоптичну загибель клітин карциносаркоми щурів W256 [Tang D. G. et al., 1996], пухлинних клітин лінії Р-388 [Korystov Yu. N. et al., 1998] та стимульованих гладеньком'язових клітин судин [Nishio E., Watanabe Y., 1997]. Вміст апоптичних та некротичних гепатоцитів у культурі при дії блокаторів ліпоксигеназ вивчали за допомогою подвійного забарвлення ядер. Встановлено, що у присутності блокаторів кількість апоптичних клітин у культурі збільшувалась (рис. 1). Вперше було показано, що загальний блокатор ліпоксигеназ – НДГК і блокатор 5-ліпоксигенази – КК викликають процеси апоптозу в первинній культурі гепатоцитів, які морфологічно виявляються вже через 4 год і посилюються через 24 год. Так, у присутності НДГК кількість апоптичних клітин збільшувалась у порівнянні з контролем через 4 год у 2 рази, а через 24 год – у 3, 6 рази. У присутності КК вміст апоптичних гепатоцитів у культурі через 4 і 24 год також зростав, хоча і в меншій мірі порівняно з НДГК (Р<0, 05). Через 24 год після впливу НДГК,