Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику

Відомо, що при дії ГТФS G-білки активуються повільно і практично не зворотно, що давало можливість більш детально дослідити роль активованих G-білків у модуляції властивостей катіонної провідності. При додаванні ГТФS до піпеточного розчину (0, 2 мМ) фаза активації IКАТ звичайно тривала 3-5 хвилин після прориву мембрани під піпеткою, після чого струм лишався дуже стабільним на протязі десятків хвилин. При цьому спостерігалася потенціалзалежність кінетики активації, що була дуже подібною до активації IКАТ карбахоліном: струм наростав швидше усього при 80 мВ, повільніше при  40 мВ і ще більш повільно при  120 мВ. Спостерігався цікавий феномен перетину амплітуд IКАТ при -40 і 120 мВ. Такий же перетин спостерігався і у вищеописаних експериментах при дії КХ – ранній на початку дії агоністу і пізній у процесі десенситизації рецепторів.

Кінетика розвитку струму відповідала припущенню про різні вимоги стосовно активованих G-білків при різних потенціалах. Відповідно до цієї гіпотези, при 80 мВ IКАТ найкраще відображає власне процес збільшення їхньої концентрації, тоді як при  40 і  120 мВ спостерігається процес кооперативної взаємодії декількох активованих молекул G-білка з каналом. Як відомо, кооперативність взаємодій у системі припускає сигмовидну кінетику, саме це і спостерігалося в даних експериментах при від’ємних потенціалах. По своїм амплітудним, кінетичним і потенціалзалежним властивостям обидва струми при їхній максимальній активації (максимальна відповідь на КХ або 3-5 хвилин після початку дії ГТФS) практично не відрізнялися.

Вольтамперні залежності для IКАТ при дії ГТФS, отримані з інтервалом 20 с, показані на рис. 7А. Очевидно, що як і у випадку підвищення концентрації КХ форма кривих змінюється, а лінійна ділянка характеристики прогресивно подовжується в область від’ємних потенціалів. Відповідні активаційні криві показані на рис. 7В – спостерігалося поступове збільшення максимальної провідності і паралельний зсув у негативну область. Релаксації струму при  120 мВ теж зазнавали змін, характерних для описаних вище при підвищенні концентрації КХ, які могли пояснюватися зміною V1/2 (рис. 7Б).

Результати даних експериментів показують, що при активації G-білків катіонні канали не тільки відкриваються, але і відбувається модуляція їх властивостей. Єдиний процес, що залежить від концентрації активованих G-білків, визначає кількість активованих каналів (Gmax), положення активаційної кривої на вісі потенціалів і відповідно кінетику релаксації при даному потенціалі (рис. 7Г).

Для різних типів каналів (наприклад, NMDA рецептори у нейронах) показано, що нелінійні вольтамперні характеристики можуть виникати внаслідок потенціалзалежної блокуючої дії двовалентних катіонів або протонів. В контрольних дослідах було знайдено, що зовнішні іони Ca2+, Mg2+ і Н+ досить сильно пригнічують IКАТ, але детальний аналіз показав, що дані ефекти обумовлені лише зміною величини поверхневого потенціалу в результаті титрування негативно заряджених груп поблизу каналу. Деякі відміни у дії Ca2+ і Mg2+ (наприклад, зміна крутизни активаційної кривої при додаванні Ca2+) можна було пояснити проникністю каналу до Ca2+ і активуючою дією до того, як Ca2+ встигає зв'язатися з BAPTA усередині клітини.

Властивості поодиноких катіонних каналів

Найбільш прямі докази потенціалзалежності катіонних каналів можна було б одержати на рівні реєстрації активності поодиноких каналів. На рис. 8А показані приклади таких реєстрації при різних потенціалах. Крім основного каналу з провідністю біля 40-50 пС у деяких випадках був присутній канал меншої провідності, 8 9 пС, проте його активність не аналізувалася, тому що його внесок був незначним.

Розподіл часів закритого і відкритого станів мав дві постійних часи, що свідчить про наявність як мінімум двох закритих і двох відкритих станів. Слід зазначити, що спад макроструму при зсуві мембранного потенціалу добре описувався однієї експонентою (рис. 5, 7Б) із постійною часу звичайно в межах 20-200 мс, що відповідає довготривалому відкритому стану. Питома вага короткотривалого відкритого стану, очевидно, невелика, а його час життя 1-2 мс лише в 2-3 рази перевищує постійну часу ємнісного артефакту при реєстрації від цілої клітини.

Провідність каналу при потенціалах від  70 до  20 мВ була у середньому 42, 1±3, 7 пС (n=14) і не відрізнялася для умов активації каналу КХ (38, 5±6, 9 пС, n=6) або ГТФS (44, 8±4, 1 пС, n=8)  (P>0, 4). Залежність вірогідності відкритого стану (Ро) від мембранного потенціалу описувалася рівнянням Больцмана (рис. 8Б) з V1/2 для різних клітин у межах від  45 до  140 мВ і k від  18 до  24 мВ. Це добре співвідносилося із відповідними параметрам активаційних кривих макроструму.

Великий інтерес являло з'ясовування причини зниження Ро при гіперполяризації мембрани. Для макроструму це відповідало релаксації при  120 мВ до рівня, менше ніж амплітуда струму при  40 мВ (рис. 5), і виражалося в U-подібній формі вольтамперної характеристики (рис. 6Б). На рис. 8 Ро при  10 мВ була 0, 9 при відсутності подвійних відкривань на протязі досить тривалого часу спостереження, тобто у фрагменті мембрани знаходився лише один канал. Таким чином, можна було аналізувати його кінетику. Залежність постійних часу, що описують розподіли часів життя каналу у відкритому і закритому станах, показана на рис. 8 В і Г, відповідно. Обидва постійні часи для відкритого стану зменшувалися при гіперполяризації,