Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику

Механізми вивільнення Ca2+ із внутрішньоклітинних депо ГМК

При холінергічній активації ГМК паралельно із деполяризацією мембрани та входом Ca2+ ззовні відбувається також вивільнення Ca2+ із СР, що включає як КІВК, так і InsP3-індуковане вивільнення Ca2+ (ІІВК)  (Karaki et al., 1997). У досліджуваних ГМК ileum морської свинки Ca2+ депо є спільним для обох процесів (Komori et al., 1995). Посилення входу Ca2+ за допомогою КІВК і фізіологічна значимість цього механізму в різноманітних ГМК зараз не викликає сумніву, а розвиток методів реєстрації [Ca2+]i за допомогою конфокальної флуоресцентної мікроскопії показав високу просторову і тимчасову структурованість Ca2+ сигналу. Проте до моменту початку даних досліджень для гладеньких м'язів фізіологічна роль КІВК лише передбачалася, в основному на підставі реєстрації скорочувальних реакцій при дії агоністів і кофеїну (Karaki et al., 1988). Експерименти на скінованих сапоніном ГМК свідчили про те, що КІВК може активуватися при [Ca2+]i>1 M, що таким чином виключало його фізіологічну значимість (Iino, 1989).

Як можливу стратегію дослідження було використано зіставлення ICa і IK (Ca), або ICa і катіонного струму, що виникає при активації мускаринових рецепторів (IКАТ). IКАТ корелює із змінами [Ca2+]i навіть більш тісно у порівнянні з IK (Ca)  (Komori et al., 1993), і, таким чином, обидва струми могли бути інтерпретовані як якісний показник рівня [Ca2+]i.

Регенеративний характер КІВК

При тривалій деполяризації мембрани розвивався затриманий вихідний струм (рис. 2Б). Аналогічний струм виникав і при аплікації кофеїну або фотолізі "caged" InsP3 усередині клітини, що послужило підставою для припущення про участь іонів Ca2+, що вивільнюються з СР, в активації цього струму, ідентифікованого як IK (Ca). Зіставлення кінетики ICa і IK (Ca), а також відповідних вольтамперних залежностей (рис. 2Б) свідчило про непряму роль входу Ca2+ в активації затриманого IK (Ca). Кофеїн широко використовується як фармакологічний інструмент для подібного роду досліджень, проте крім активації ріанодінових рецепторів у мембрані СР він може викликати й інші ефекти. Дійсно, було знайдено, що у концентрації 10 мМ кофеїн викликав пригнічення ICa приблизно на 30%. Такий ефект не міг пояснити повне блокування затриманого IK (Ca) у присутності кофеїну, яке вірогідно виникало внаслідок спустошення СР. Рослинний алкалоїд ріанодин (5 М), рутенієвий червоний (10 *М) і підвищення внутрішньоклітинної концентрації Mg2+ до 6 мМ практично цілком блокували затриманий IK (Ca). Було очевидним, що цей струм виникає внаслідок КІВК, що активується входом Ca2+ при деполяризації мембрани.

Подальші експерименти були спрямовані на з'ясовування властивостей КІВК, аналізуючи при цьому затриманий IK (Ca) і його співвідношення з амплітудою ICa. Вихідний струм, чутливий до рутенієвого червоного, починав зменшуватися при потенціалах, значно більш позитивних, ніж можна було б очікувати для “градуального“ КІВК, пропорційного входові Ca2+ (рис. 2Б). У інших серіях експериментів була досліджена залежність амплітуди IK (Ca) від частково інактивованого або частково блокованого ніфедипіном ICa (рис. 3). Виявилося, що затриманий IK (Ca) починає зменшуватися по амплітуді лише після пригнічення ICa на 80-95%. Ці результати, отримані з використанням різних експериментальних підходів, вказували на регенеративний характер процесу КІВК у ГМК ileum морської свинки. Вхід Ca2+, навіть невеликий, може відігравати роль пускового механізму, що активує КІВК. Сама наявність вихідного струму, що активується при виникненні КІВК, свідчила про істотне підвищення [Ca2+]i на додаток до викликаного безпосередньо вхідним Ca2+ струмом, і таким чином фізіологічну значимість КІВК.

Ca2+-залежна модуляція ІІВК

У ГМК формування InsP3 при дії різноманітних агоністів пов'язано зі скороченням, що обумовлено підвищенням [Ca2+]i у наслідок ІІВК. Іони Са2+ також можуть зв'язуватися з InsP3 рецепторами і модулювати їхню активність, у такий спосіб регулюючи ІІВК за принципом зворотного зв'язку (Bezprozvanny & Ehrlich, 1995). У стаціонарних умовах залежність активності InsP3 рецепторів від концентрації Са2+ є -образною з максимумом біля 300 нМ. Важливо відзначити, що кінетика дії Ca2+ на ІІВК також є складною і у цілому вивчена набагато гірше. У більшості робіт дослідження проводилися з використанням неклітинних експериментальних моделей (везикули СР, скіновані клітини, InsP3 рецептори у біслоях) або ж на незбудливих клітинах (наприклад, ооцити Xenopus). Такі підходи мають свої переваги, проте вони не дозволяють відповісти на запитання про можливу модуляцію ІІВК іонами Са2+, що входять у клітину через потенціалзалежні Са2+ канали.

З метою з’ясування цих питань InsP3 раптово вивільнювався з інертного «caged» InsP3 при спалаху світла і одночасно реєструвався IK (Ca), по амплітуді якого оцінювали зміни концентрації іонів Са2+ з внутрішньої поверхні мембрани. В залежності від інтенсивності світла спостерігалися моно- або двофазні відповіді. Однієї з можливих причин генерації двофазних відповідей могла бути активуюча дія Са2+, що вивільняється на ранній стадії ІІВК, на наступний процес його вивільнення. Дійсно, деполяризуючий імпульси, що супроводжувалися входом Са2+, підсилювали дію InsP3. Цей ефект починався на протязі 30-100 мс після завершення деполярізації, досягав максимуму приблизно за 250 мс, а потім змінявся пригніченням відповіді на InsP3. У дослідах з двома спалахами якщо час між ними становив 0.