Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику

Реєстрація іонних струмів. Для дослідження інтегральних іонних струмів застосовувався стандартний метод фіксації потенціалу і внутрішньоклітинної перфузії за допомогою скляної мікропіпетки в конфігурації whole-cell (Hamill et al., 1981). Активність поодиноких іонних каналів досліджувалася у конфігураціях cell-attached і outside-out. У деяких експериментах використовувалася методика подвійної patch-реєстрації (комбінація whole-cell і cell-attached конфігурацій). Після заповнення відповідним розчином піпетки мали опір 1-3 МОм. Послідовний опір складав у середньому 8, 4 МОм і компенсувався на 80%. У більшій частині експериментів використовувався підсилювач фіксації потенціалу Axopatch 200A і інтерфейс Digidata 1200, керований програмою pClamp 6. 0 (Axon Instruments). Дані аналізувалися за допомогою програм pClamp 6 і MicroCal Origin 5. 0. Для реєстрації швидких іонних струмів (наприклад, ТТХ-чутливий Na+ струм) сигнал фільтрувався за допомогою фільтра Бесселя 4 го порядку з частотою зрізу 5 кГц і записувався при 40 кГц; при реєстрації активності поодиноких іонних каналів ці величини були 1-2 кГц і 5-10 кГц, відповідно, а при реєстрації катіонних струмів – 1 і 5 кГц, відповідно.

Техніка фотолізу. Світло ксенонової лампи (спалах тривалістю 1 мс, 300<<380 нм) фокусувалося на клітину, що попередньо перфузувалася не менше 5 хвилин розчином з “caged“ речовиною. Інтенсивність спалаху регулювалася шляхом зміни напруги заряду конденсатора (НЗК), тоді як момент подачі спалаху задавався синхроімпульсом із регульованою затримкою відносно імпульсу фіксації потенціалу. Відсоток конверсії складав 2, 2±0, 3 при НЗК 40В і 8, 6±0, 4 (n=5) при НЗК 75.

Склад і зміна розчинів. Нормальний зовнішній розчин містив (ммоль/л) : 120 NaCl, 6 KCl, 2, 5 CaCl2, 1, 2 MgCl2, 11, 5 глюкоза, 10 HEPES (pH 7, 4; NaOH). Для реєстрації Na+ струмів KCl замінявся на CsCl, а CaCl2 – на MgCl2. У клітинах, де були присутні Na+ канали (нейрони, ГМК ileum щура), Са2+ струми реєструвалися при заміні NaCl і KCl на 130 мМ ТЕА-Cl, а в усіх інших випадках – при заміні KCl на CsCl. Катіонні струми при активації мускаринових рецепторів реєструвалися у розчині такого складу (ммоль/л) : 120 CsCl, 12 глюкоза, 10 HEPES (pH 7, 4; CsOH). Розчин у піпетці мав такий склад: 85 KCl, 30 KH2PO4, 1 MgSO4, 1 Na2ATФ, 5 креатин, 20 глюкоза, 10 HEPES (pH 7, 4; NaOH), 0, 05-5 ЕГТА в залежності від мети експерименту. Для реєстрації Са2+ струму KCl і KH2PO4 замінювалися на 115 мМ CsCl. Для реєстрації K+ і Ca2+ або Na+ струмів у ГМК ileum щура розчин містив відповідно 130 мМ KCl або CsCl, добавлялося також 0, 1 мМ цАМФ. Розчин для дослідження катіонного струму при активації мускаринових рецепторів містив 80 CsCl, 1 MgCl2, 1 Na2АТФ, 5 креатин, 10 BAPTA, 4, 6 CaCl2 ([Ca2+]i=100 nM), 20 глюкоза, 10 HEPES (pH 7, 4; CsOH).

Зовнішній розчин мінявся у всьому об’ємі експериментальної камери (~0, 4 мл) за час, що не перевищував 1 с. У деяких експериментах, наприклад, при вимірі латентного періоду виникнення катіонного струму при аплікації карбахоліну, була потрібна більша швидкість аплікації. В цих випадках використовувалася п’езоелектрична позиційна система PCS-250, яка дозволяла змінити розчин на протязі приблизно 1 мс.

Статистичні методи. Результати статистичного аналізу експериментальних даних представлені як середнє арифметичне ± стандартна помилка середнього арифметичного (n – кількість вимірів). Для статистичного порівняння використовувався t-критерій Стьюдента, розходження приймалися як достовірні при P<0, 05.

Дані описувалися відповідними математичними функціями з використанням програмного забезпечення Origin. Концентраційні залежності та активаційні/інактиваційні криві описувалися, відповідно, такими рівняннями:

 

  (1)   (2)

де Y – вимірювана величина (струм або мембранна провідність), Ymax – її максимальне значення, EC50 і V1/2 – параметри, при яких Y=Ymax, а p і k – чинники нахилу кривої.

 

 

Іонні струми мембрани нейронів інтрамуральних гангліїв.

Електрична активність міентеральних нейронів є тою початковою ланкою, що призводить до вивільнення у нервових закінченнях ацетилхоліну і запуску цілого каскаду складних реакцій, опосередкованих активацією мускаринових рецепторів ГМК і координуючих скорочувальну активність кишечнику. Характер активності відрізняється в різноманітних ділянках травного тракту і між нейронами різних типів. Ці дані базуються в основному на експериментах із використанням мікроелектродних методів реєстрації (Wood, 1989), тоді як із застосуванням методу patch-clamp досліджувалися лише нейрони новонароджених тварин, властивості яких можуть істотно відрізнятися від нейронів дорослих тварин. В умовах фіксації току більшість досліджуваних нейронів генерували лише 1-2 потенціалу дії з наступною тривалою слідовою гіперполяризацією, що дозволяло віднести їх до AH/тип 2 нейронів.

Потенціалкеровані натрієві і кальцієві струми

Вхідній струм складався зі швидкого і повільного компонентів. Швидкий струм зникав у безнатрієвому розчині і блокувався тетродотоксином (ТТХ, IC50=10, 7 нМ), але зберігався в безкальцієвому розчині і був таким чином ідентифікований як Na+ струм. Навпроти, повільний компонент струму зберігався в безнатрієвому розчині і змінювався по амплітуді в залежності від [Ca2+]o і був ідентифікований як ICa. INa досягав максимального значення при  10 мВ (2, 2±0, 3 нА, n=15). При більш позитивних потенціалах внесок ICa збільшувався, максимум току спостерігався при 10 мВ (0, 8±0, 1 нА, n=15).

При деполяризації Na+ канали інактивувалися з однією