Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику

Таким чином, властивості поодиноких каналів цілком пояснюють потенціалзалежні релаксації і складну форму вольтамперної характеристики інтегрального IКАТ.

Механізми десенситизації катіонної провідності

Десенситизація відповідей, що виникають при активації мембранних рецепторів, є важливим фізіологічним захисним і адаптивним клітинним механізмом і являє собою складний і цікавий біофізичний феномен, тому що молекулярні механізми є надзвичайно різноманітними і не цілком з’ясованими (Grady et al., 1997). У експериментах по десенситизації IКАТ був виявлений принципово новий механізм, обумовленої вичерпанням запасу ГТФ у клітині при її інтенсивному гідролізі у процесі активації G-білків. У дослідженнях на інших типах клітин такий механізм не проявлявся (Mubagwa et al., 1994), що пояснювалося високою спорідненістю G-білків до ГТФ. Значне збільшення IКАТ при вивільненні ГТФ із “caged” ГТФ у попередніх експериментах свідчило про наявність значного “резерву” катіонних каналів і неактивних G-білків внаслідок обмеженої кількості молекул ГТФ.

Насамперед були проаналізовані залежності амплітуди IКАТ від концентрації КХ без додавання і з додаванням 1 мМ ГТФ до піпеточного розчину. Криві концентрація-ефект при повторних аплікаціях КХ характеризувалися зменшенням максимальної провідності, що було статистично достовірним тільки при відсутності ГТФ. Спостерігалася лише тенденція до зростання ЕС50. Таким чином, наявність ГТФ мала в основному значення для величини Gmax, яке відповідає максимально можливому для даної клітини кількості активних каналів. Функція власне мускаринового рецептора при десенситизації практично не змінювалася. Важливо відмітити, що при наявності ГТФ у внутрішньоклітинному розчині вищеописані зміни форми вольтамперної залежності і величини V1/2 у процесі десенситизації (рис. 6) були повністю відсутні. Така стабільність спостерігалася і для ГТФS-індукованого струму, що не дивно, оскільки у цьому випадку ГТФ для активації G-білків не потрібен.

З метою більш детального з'ясування ролі G-білків у процесі десенситизації IКАТ до піпеточного розчину додавалися різноманітні гуанінові нуклеотиди. Слід зазначити, що амплітуда, кінетика і форма вольтамперної залежності IКАТ на максимумі відповіді залишалися практично без змін, а основні ефекти нуклеотидів виявлялися тільки у часі по мірі десенситизації IКАТ (рис. 9). Десенситизація значно прискорювалася при додаванні 50 М ГДФS і сповільнювалася при додаванні 1 мМ ГТФ. Найбільше повільним був спад струму, активованого ГТФS. У цих випадках відбувалася зміна лише розміру Gmax без істотних змін положення активаційної кривої на вісі потенціалів.

Важливо також відмітити, що швидкість десенситизації залежала від мембранного потенціалу. Десенситизація була практично відсутня при 80 мВ (за винятком, коли додавався ГДФS), але значно прискорювалася при гіперполяризації мембрани (рис. 9). Це додатково підтверджувало вищезгадану гіпотезу про те, що навіть невелика концентрація активованих G-білків достатня для відкривання катіонних каналів при позитивних потенціалах.

Значний інтерес мало дослідження процесу десенситизації на рівні зміни активності поодиноких каналів. Ці експерименти проводилися в конфігурації “outside-out” із додаванням 1 мМ ГТФ до піпеточного розчину в постійній присутності 50 *М КХ у зовнішньому розчині. Для макрострумів за таких умов характерним було зменшення максимальної провідності, що звичайно інтерпретується як зменшення кількості активних каналів, без зміни інших параметрів активаційної кривої (V1/2 або k). Оскільки, як показано вище, активаційна крива визначається залежністю Ро від мембранного потенціалу (рис. 8Б), можна було очікувати постійність Ро при фіксованому потенціалі. Експериментальні результати підтверджували ці припущення. Якщо на початку експерименту у досліджуваному фрагменті мембрани виявлялося як мінімум 4 активних канали, то з часом залишався лише один активний канал, але Ро при цьому не зменшувалася. Провідність каналу також не змінювалася.

Роль підтипів мускаринових рецепторів у розвитку IКАТ

Дослідження механізмів десенситизації IКАТ дозволило створити надійну експериментальну систему для проведення кількісних фармакологічних досліджень на поодиноких ГМК. В усіх експериментах даного розділу до піпеточного розчину додавалося 1 мМ ГТФ. Аналіз базувався на вимірах величини ЕС50 для КХ до і після аплікації антагоніста мускаринових рецепторів. Задача визначення типу мускаринового рецептора, що активує катіонний канал, фактично зводилася до з'ясування ролі М2 і М3 рецепторів, тому що, як вже відзначалося, у ГМК ileum присутні лише ці два підтипи рецепторів.

Для аналізу були використані М2-селективні антагоністи метоктрамін, гімбацин і тріпітрамін і М3-селективні антагоністи p-F-HHSiD, 4-DAMP і заміфенацин. Потреба використання декількох антагоністів обумовлена відсутністю абсолютної селективності. Кількісний аналіз проводився з використанням рівняння Шилда, наведеного на рис. 10, де DR – це відношення ЕС50 при дії антагоніста і у контролі, [B] – концентрація і Kb – константа дисоціації антагоніста. На рис. 10 показано, як приклад, експеримент по визначенню величини Kb для метоктраміну і його аналіз у рамках теорії Шилда. Усі інші М2-селективні антагоністи діяли аналогічним чином, тобто спостерігався паралельний зсув концентраційної кривої без суттєвого зменшення максимальної відповіді. Це свідчило про конкурентний тип блокування, а співставлення отриманих величин констант дисоціації із відомими для