Мембранні та внутрішньоклітинні механізми М-холінергічної активації гладеньком’язових клітин тонкого кишечнику

7. Досліджена роль G-білків у карбахолінзалежній модуляції Ca2+ струму і дана порівняльна характеристика активації катіонного струму і пригнічення Ca2+ струму.

Практичне значення отриманих результатів

Дана робота носить в основному теоретичний характер і значно поглиблює і розширює сучасні уявлення відносно механізмів вивільнення Ca2+ у ГМК і генерації збудження при активації мускаринових рецепторів. Значимість отриманих результатів цим не обмежується, оскільки даний тип мембранних рецепторів належить до великого сімейства так званих 7 ТМ рецепторів, що нараховує до двох тисяч представників. Структура, механізми активації і передачі сигналу для цих рецепторів багато у чому подібні, тому їх визначення для одного із представників має велике загальнобіологічне значення. Про практичну значимість 7-ТМ рецепторів свідчить той факт, що дія близько 60% ліків спрямована саме на ці рецептори. Зокрема, антагоністи мускаринових рецепторів застосовуються при лікуванні різних захворювань, обумовлених підвищеною реактивністю і моторикою гладеньких м'язів (дисфункція кишечнику і січового міхура, обструкція дихальних шляхів, бронхіальна астма, пептична виразка, та ін.). Таким чином, дослідження механізмів холінергічного контролю діяльності гладеньких м'язів створює теоретичну основу для цілеспрямованого пошуку селективних фармакологічних препаратів і більш ефективної корекції різних патологічних станів.

Особистий внесок здобувача

Автор самостійно розробив методики отримання поодиноких ГМК і провів переважну більшість експериментів, їх статистичну обробку, аналіз і узагальнення результатів, а також готував до друку наукові статті. Деякі експерименти було виконано спільно з іншими дослідниками з приблизно однаковим внеском:

1.Дослідження іонних струмів у мембрані ГМК тонкого кишечнику щура – С. В. Смірнов (Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України).

2.Дослідження іонних струмів у мембрані нейронів міжм’язового плетива тонкого кишечнику морської свинки – Л. В. Байдан (Інститут фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України; Державний університет штату Огайо, США).

3.Дослідження пригнічуючої дії Ca2+ на InsP3-індуковане вивільнення Ca2+ – С. Коморі (Університет Гіфу, Японія).

4.Дослідження дії карбахоліну на Ca2+ канали ГМК ileum морської свинки – В. Пуцовський (Інститут експериментальної фармакології Академії наук Словаччини).

Апробація роботи

Основні положення дисертації були представлені на семінарах Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України (1988-1997), відділу фармакології і клінічної фармакології Медичної школи госпіталю Св. Георгія (Лондон) і Інституту експериментальної фармакології Академії наук Словаччини (Братислава), на 5-му Міжнародному симпозіумі “Фізіологія і фармакологія гладеньких м'язів“ (Варна, 1988), на Всесоюзних симпозіумах ”Поодинокі канали у біологічних мембранах“ (Пущино, 1989; Москва, 1990), на ХIII з'їзді Українського Фізіологічного товариства (Харків, 1990), на Радянсько-Іспанському симпозіумі по фізико-хімічній біології (Київ, 1990), на засіданнях FASEB (Атланта, 1991; Лос Анжелес, 1992), на Конференції по захворюваннях травного тракту (Новий Орлеан, 1991), на засіданні Американської Асоціації гастроентерологів (Сан Франциско, 1992), на 2-му Міжнародному симпозіумі по взаємодії мозок – травний тракт (Кембридж, 1992), на ХХХII Міжнародному Фізіологічному конгресі (Глазго, 1993), на трьох засіданнях Фізіологічного товариства Великобританії (Кембридж, 1994; Лондон, 1996), на 1 му Конгресі Українського біофізичного товариства (Київ, 1994), на спільному засіданні Фізіологічних товариств Японії, Великобританії і країн Європи (Нагоя, 1995), на засіданнях Біофізичного товариства США (Балтімор, 1996; Новий Орлеан, 1997), на 7 му Міжнародному симпозіумі по підтипах мускаринових рецепторів (Відень, 1997), на спільному засіданні Фізіологічних товариств Великобританії і Чехії (Прага, 1998), на засіданні Сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О. О. Богомольця НАН України (1999).

Публікації

Результати роботи опубліковані у 27 статтях вітчизняних та міжнародних журналів та в 26 тезах наукових симпозіумів.

Структура та обсяг дисертації

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, результатів дослідження (8 розділів), аналізу і узагальнення результатів, висновків та списку 284 використаних літературних джерел. Робота викладена на 278 сторінках, містить 2 таблиці та ілюстрована 101 рисунком.

 

 

Об’єкти досліджень. Досліди проводилися на поодиноких ізольованих та культивованих клітинах. Поодинокі ГМК подовжнього шару ileum морської свинки і щура одержували за допомогою методу ферментативної та механічної ізоляції. Невеличкі шматочки м'язової тканини поміщалися у безкальцієвий розчин, що містив колагеназу (1 мг/мл), соєвий інгібітор трипсину (1 мг/мл) і бичачий альбумін (1 мг/мл), на 25-30 хвилин при 36*С, після чого старанно відмивалися від ферменту і багаторазово пропускалися через скляну піпетку. Для виділення ГМК ileum новонароджених щурів (вік 1-3 дня, вага 5-9 г) концентрація колагенази була 0, 7 мг/мл, еластази – 0, 3 мг/мл, бичачого альбуміну – 2 мг/мл, час інкубації складав 13-17 хвилин. Для дорослих щурів (2, 5-3 місяця, вага 90-120 г) концентрації ферментів збільшувалися у два рази, а час інкубації становив 50-60 хвилин.

ГМК тонкого кишечнику людини (American Type Culture Collection 1692- CRL) утримувалися у модифікованому культуральному середовищі Дюльбеко (DMEM) із додаванням 10% бичачої ембріональної сироватки, 100 U/мл пеніциліну і 100 U/мл стрептоміцину. Використовувалися клітини пасажів 16 і 17.

Для одержання первинної культури нейронів міжм’язового плетива тонкого кишечнику морської свинки ганглії збиралися після обробки тканини, як описано вище, і утримувалися в зволоженій атмосфері 5% СО2 при 37* С в середовищі 199 із додаванням 10% інактивованої теплом бичачої ембріональної сироватки, 33 мМ глюкози, 100 U/мл пеніциліну, 0, 1 мг/мл стрептоміцину, 0, 1% фунгізона і 0, 5% гентаміцина. Використовувалися нейрони, які знаходилися