Методика дослідження кліщових бореліозів

5. Обробка сироватки 25% суспензією каоліну частково або повністю вилучає з неї імуноглобуліни класу М, або ранні специфічні антитіла, тоді як екстрагування ацетоном – більш м'який метод обробки. Проте метод вилучення неспецифічних інгібіторів каоліном можна рекомендувати для використання, як більш простий.

6. Титр специфічних антитіл в оброблених для дослідження в РГГА сироватках (в розведенні 1: 10) зберігається майже без змін протягом декількох тижнів, якщо сироватки утримувати в добре закритих гумовими корками флаконах або запаяних ампулах.

7. З метою економії інгредієнтів рекомендується проводити обстеження сироваток в РГГА в два етапи: 1) досліджувати всі сироватки в розведенні 1: 10, 1: 20 і 1: 40; 2) сироватки, що пригнічують гемаглютинацію в титрі 1: 40, розтитровувати повторно в розведеннях до 1: 1280 – 1: 2560.

Реакція зв'язування комплементу (РЗК)

РЗК виконують у відповідності до інструкції з підготовки цієї реакції, що додається до діагностикуму, який випускає підприємство-виробник. Як доповнення до цієї інструкції необхідно мати на увазі:

1. рН фізіологічного розчину для РЗК повинно дорівнювати 7, 2. В середовищі з неоптимальним рН чутливість реакції знижується. Чутливість і специфічність РЗК в більшості залежить від точності вимірювань при виконанні дослідів і ретельності стандартизації реагентів по відношенню один до другого, особливо при постановці реакції в малих об'ємах. Неточності, що допускаються по відношенню до будь-якого з п'яти компонентів РЗК, призводять до значної сумарної помилки кінцевого результату і неможливості його відтворювання при повторній реакції.

2. Перед початком дослідження будь-якої серії діагностикуму необхідно визначити, чи відповідає його робочий титр зазначеному на етикетці ампули. З цією метою проводять шахове титрування: крім робочого, в досліді використовують розведення антигену в 2 і в 4 рази менше і більше, титрують із більшими розведеннями специфічної сироватки (1: 8, 1: 16 і так далі до розведення, яке в 2 рази перевищує зазначений на етикетці титр). Контролями до цього тесту є: а) реакція специфічної сироватки (у всіх розведеннях) з нормальним антигеном у розведеннях, що відповідають його робочому титру та в 2 і 4 рази нижчих; б) реакція нормальної сироватки в розведенні 1: 8, 1: 16 із специфічним діагностикумом в розведеннях, що відповідають робочому, і у 2 і 4 рази нижчих за них; в) контроль специфічної сироватки 1: 8, 1: 16; г) контроль нормальної сироватки 1: 8, 1: 16.

При використанні комерційних антигенів дослід шахового титрування виконують одночасно в двох-трьох варіантах з усіма дозами комплементу, що запропоновані інструкцією.

Одиницею антигену, або його титром, вважають його найбільше розведення, що дало повне або майже повне зв'язування комплементу з найбільшим розведенням сироватки. Специфічний діагностикум придатний для використання, якщо його титр не нижчий за вказаний в нструкції (вимога придатності антигену при проведені переконтролю).

3. Антикомплементарні властивості деяких сироваток перешкоджають їх дослідженню. Природа антикомплементарних властивостей різна. У одних людей сироватка антикомплементарна завжди, у інших ця властивість з'являється періодично. Сироватки, що позбавлені цих властивостей, можуть їх набути внаслідок бактеріальної контамінації або хімічного забруднення, в тому числі і продуктами гемолізу еритроцитів.

Для звільнення сироватки від антикомплементарних властивостей запропоновані наступні методи:

а) інактивація 20 хвилин при +65 град. C (замість +60 град. C) ;

б) інактивація 20 хвилин при +60 град. C, яка проводиться два дні поспіль;

в) додавання комплементу – на 4 об'єми нерозведеної сироватки додається 1 об'єм нерозведеного комплементу, суміш витримують протягом ночі при +4 град. C, потім прогрівають 30 хвилин на водяній бані при +37 град. C, додають фізіологічний розчин до розведення сироватки 1: 4 або 1: 8 (до початкового розведення для РЗК) і прогрівають 30 хвилин при +60 град. C.

Всі ці методи можуть дещо знижувати специфічний титр, тому необхідно аналогічним чином обробляти всі зразки цього хворого, незалежно від наявності чи відсутності антикомплементарних властивостей його сироватки;

г) сироватки, що одержані з дуже гемолізованих зразків, стають придатними для дослідження тільки після адсорбції гамаглобуліна на іонообмінниках Сефадекс СМ-75 або СМ-100.

Імунноферментний аналіз (ІФА)

Метод заснований на принципі сорбції білків на твердій фазі з наступним утворенням комплексів антиген – антитіло, що виявляється субстратіндикаторним розчином. В комерційних тест-системах в лунках планшет міститься специфічний вірусний імуноглобулін (або його вносять самостійно). Антиген, що додається в лунки мікропланшети, специфічно зв'язується з антитілами. На шар антигену наноситься досліджувана сироватка людей в потрібних розведеннях. При наявності в сироватці специфічних антитіл останні зв'язуються з антигеном. Для виявлення зв'язування на шар антитіл наноситься імуноглобулін проти глобулінів сироватки людини, який кон'югований з пероксидазою хрону. Кількість сорбуючого кон'югату пропорційна кількості антитіл сироватки людини, що зв'язалися з антигеном. Цю кількість можна визначити за ступенем забарвлення, використовуючи субстратіндикаторний розчин (ортофенілендіамін + + перексид водню), компоненти якого внаслідок дії пероксидази кон'югату забарвлюють розчин в брунатно-жовтий колір.

Оцінка результатів серологічної діагностики

Серологічний діагноз заснований на визначені специфічних антитіл у діагностичному титрі або його зростанні (чотирьохразовому і вище).

У таких випадках клінічний діагноз вважають достовірно підтвердженим. Стабільний титр антитіл у всіх зразках крові хворого, які забирали в різні строки від початку хвороби, не є вірогідним свідоцтвом для підтвердження або