Методика дослідження кліщових бореліозів

На кожний зразок, направлений до лабораторії для серологічного дослідження, заповнюється «Направлення на аналіз» (облікова форма N 200/о) із зазначенням номеру зразка (I, II).

Парні проби сироваток крові повинні досліджуватись одночасно. У зв'язку з цим до поступлення другої проби сироватки лабораторія повинна забезпечити правильне зберігання перших зразків. На ампули або флакони (ємкістю 5 мл) з пробами наклеюють етикетки, на яких зазначають лабораторний номер реєстрації та черговості взяття зразка (I, II, III). Реєстрацію матеріалу, що надійшов на аналіз, проводять у «Журналі реєстрації серологічних досліджень» (Ф. N 259/о). Лабораторіям обласних СЕС доцільно розподілити записи таким чином: відвести декілька сторінок для кожного адміністративного району, а хворих обласного центру записувати в алфавітному порядку, залишаючи кілька сторінок для кожної початкової літери. Така форма запису значно спрощує реєстрацію матеріалу, що надійшов повторно[14].

Робота, що стосується збору, зберігання, транспортування і вірусологічного дослідження матеріалів від хворих та з природних вогнищ на КВЕ, проводиться при суворому дотриманні режиму, який забезпечує безпеку персоналу (див. «Положення про порядок обліку, зберігання, обігу, відпускання та пересилання культур бактерій, вірусів, рикетсій, грибів, найпростіших, мікоплазм, бактеріальних токсинів, отрут біологічного походження». Міністерство охорони здоров'я СРСР, 1980 р., а також Державні санітарні правила. ДСП. 9. 9. 5. 035. 99 «Безпека роботи з мікроорганізмами I-II груп патогенності»).

 

 

РГГА виконується у відповідності до вимог інструкції з постановки цієї реакції. Інструкція додається до набору інгредієнтів для РГГА, що випускає підприємство-виробник. Як доповнення до цієї інструкції необхідно враховувати наступне:

1. Еритроцити від різних гусаків, що використовуються для РГГА, не можна змішувати, оскільки така суміш може давати неспецифічну аглютинацію. Робочу суспензію еритроцитів готують безпосередньо перед застосуванням. Рівномірний тонкий шар еритроцитів, що вистеляє дно лунки мікропанелі по всій кривизні, оцінюють як повну гемаглютинацію (при оцінці за системою «чотирьох хрестів» + + + +). У випадку утворення еритроцитами кільця на менш однорідному або більш тонкому шарі осаду реєструють часткову гемаглютинацію (+ + + або + +). Мінімальна гемаглютинація – осад у вигляді їудзика на тонкому або фрагментованому шарі еритроцитів (+ або +-). При повній відсутності гемаглютинації осад має форму компактного їудзика без ознак оточуючого тонкого шару еритроцитів

(-). Результати + + + +, + + + і + + розцінюють як доказ наявності достатньої кількості антигену в даній лунці (позитивна реакція в РГА, негативна реакція в РГГА). Результати +, +- і – розцінюють як негативну реакцію в РГА або позитивну в РГГА).

2. В РГГА антиген використовують в об'ємі 0, 2 мл або 0, 025 мл (мікротитратор Такачі або автоматична піпетка-дозатор) замість 0, 4 мл або 0, 05 мл (мікротитратор Такачі або автоматична піпетка-дозатор), які застосовуються при титруванні антигену в РГА. Тому, щоб визначити розведення антигену, яке містить 4 одиниці, в РГГА відраховують від кінцевої крапки титрування антигену не 3, а 4 розведення, а для робочого розведення, яке містить 8 одиниць, – 5 розведень. Тобто, при титрі антигену в РГА 1: 320 4 АЕ міститься в розведенні 1: 40, 8 АЕ – в розведенні 1: 20.

3. При постановці РГГА в об'ємі 0, 8 мл робоче розведення антигену повинно містити 8 одиниць в 0, 2 мл, при загальному об'ємі 0, 1 мл (мікротитратор Такачі або автоматична піпетка-дозатор) – працюють з 4 одиницями антигену в 0, 025 мл, тому що титр антигену при роботі малими об'ємами в 2 рази зменшується.

4. Неспецифічні інгібітори гемаглютинації, що звичайно наявні в сироватках, не адсорбуються на каолін, якщо проба дуже гемолізована, контамінована бактеріями, або тривалий час зберігалась при +4 град. C. В таких випадках для усунення інгібіторів застосовують екстрагування ацетоном.

Для цього 1 об'єм сироватки (0, 1 мл) розводять фізіологічним розчином в 10 разів (0, 9 мл), охолоджують на льоду і додають 12 об'ємів (по відношенню до розведеної сироватки) холодного ацетону (12 мл). Після екстрагування протягом 5 хвилин суміш центрифугують 5 хвилин при 2500 об/хв. і +4 град C. Надосадну рідину обережно (не збовтуючи осад) вилучають. Осад ресуспензують у попередньому об'ємі (12 мл) охолодженого ацетону, енергійно струшують, екстрагують на льоду 1 годину, періодично струшуючи, після чого центрифугують. Надосадну рідину вилучають. Осад висушують під вакуумом при кімнатній температурі. Випаровування ацетону необхідно проводити у витяжній шафі або добре провітрюваному приміщені. Висушений осад розводять буферним розчином з pH 9, 0 із набору для гемаглютинації так, щоб одержати розведення сироватки 1: 10 (в 1 мл). Розчинення осаду відбувається

протягом декількох годин при кімнатній температурі (при періодичному струшуванні) або протягом ночі у рефрижераторі.

При зберіганні сироваток крові при +4 град C впродовж 8-10 місяців неспецифічні інгібітори з гемолізованих і контамінованих бактеріями зразків не вдається усунути навіть обробкою ацетоном. Крім цього, ензиматична діяльність бактерій може спричинити повну деструкцію специфічних антитіл в сироватці. Такі сироватки серологічному дослідженню