Методика дослідження кліщових бореліозів

Вибір методу виділення вірусу. Для виділення збудника КВЕ найбільш придатними з культур клітин є перещеплювані культури СНЕВ, а найчутливішими з лабораторних тварин – білі миші віком 1-3 доби. Дещо менше чутлива до вірусу КВЕ культура клітин курячого ембріону, проте при відсутності клітин СНЕВ і новонароджених білих мишей її також можна використовувати для зазначеної мети.

Надійніше виділяти вірус паралельним зараженням досліджуваним матеріалом клітин СНЕВ (2 пасажі) і білих мишей, однак на практиці найчастіше доводиться обмежуватися одним з цих способів.

У випадку виділення вірусу в культурі клітин ідентифікацію (а при використанні культур клітин курячого ембріону – і індикацію) виділеного агенту проводять за методом флуоресціюючих антитіл на другому пасажі досліджуваного матеріалу.

При необхідності тривалого зберігання вірусу, культуральною рідиною, що містить вірус, заражають молодих білих мишей вагою 6-7 г. Мозок мишей, що захворіли, зберігають при температурі не вище -20 град. C.

Зараження білих мишей. Досліджуваний інокулят безпосередньо після приготування вводять новонародженим білим мишам в мозок в об'ємі 0, 01-0, 02 мл. Кожним зразком заражають 6-8 тварин (1 сім'ю). Термін спостереження – 21 день. Мозок мишей, що захворіли і загинули через 3 і більше днів після зараження, використовують для наступних пасажів.

Зараження культур клітин. Кожним зразком заражають по 2-4 пробірки з моношаром, використовуючи по 0, 1 мл інокуляту на пробірку. Адсорбцію вірусу на клітинах проводять впродовж 1 години при кімнатній температурі або 30 хвилин при +37 град. C, після чого в пробірки додають середовище підтримки (середовище 199 на розчині Ерла, pH 7, 6) з 3% прогрітої при +56 град. C (інактивованої) бичачої сироватки. В залежності від кількості вірусу в інокуляті накопичення його в культурі клітин сягає максимуму через 3-6 діб інкубації. На третю добу проводять другий пасаж досліджуваного матеріалу, за яким спостерігають протягом 7 днів.

Репродукція вірусу КВЕ в клітинах СНЕВ спричинює руйнування клітин, що обумовлено цитопатичною дією вірусу. Спостереження за інфікованими культурами проводять до появи неспецифічної дегенерації клітин в контрольних пробірках. В клітинах інших видів вірус КВЕ репродукується без ознак регулярної цитопатичної дії. В сумнівних випадках для виявлення вірусу необхідно провести додаткові пасажі.

Індикація і ідентифікація виділеного вірусу КВЕ. В культурі клітин СНЕВ вірус КВЕ виявляють за характерною цитопатичною дією, після чого ідентифікують прямим або непрямим методом флюоресціюючих антитіл. В культурі клітин курячого ембріону методом флюоресціюючих антитіл здійснюють як ідентифікацію, так і індикацію вірусу.

Вірус КВЕ у найбільшій концентрації накопичується в головному мозку новонароджених, а також молодих мишей масою 6-8 г. Тому, у випадку виділення вірусу на мишах, з мозку тварин, що захворіли на II-III пасажах вірусу, готують антиген, який використовують для подальшої ідентифікації.

Прямий і непрямий методи флюоресціюючих антитіл дозволяють здійснити експрес-індикацію вірусу КВЕ в інфікованих культурах клітин. В першому випадку клітини, зафіксовані в ацетоні, обробляють гамаглобуліновою фракцією міченої ізотіоцианатом флюоресцеїну (ФІТЦ) імунної сироватки до вірусу КВЕ, в другому – специфічною імунною сироваткою, яка містить антитіла до вірусу КВЕ, і потім відповідною антивидовою сироваткою, що мічена ФІТЦ. Мічені комерційні антивидові сироватки доступні для придбання.

Модифікація методу. Матеріалом, що містить вірус в розведенні 1: 10-1: 50, заражають культури клітин СНЕВ або курячих ембріонів, які вирощені на покривних скельцях, в пробірках або пеніцилінових флаконах. Виявлення вірусного антигену проводять на 2 добу 2-го пасажу. Для цього пінцетом виймають 4-6 покривних скелець із пробірок з зараженою і контрольною культурою, промивають їх фізіологічним розчином, висушують і фіксують охолодженим ацетоном впродовж 15 хвилин. Потім на клітини наносять по краплі розведеної 1: 10 імунної асцитної рідини або сироватки, що містить антитіла до вірусу КВЕ, після чого препарати інкубують у вологій камері при +37 град. C протягом 1 години. Після ретельного відмивання препаратів фізіологічним розчином від надлишку сироватки їх висушують, на клітини наносять суміш 1: 1 відповідного анти видового гама-глобуліну (проти глобулінів миші, іншої лабораторної тварини або людини), міченого ФІТЦ, і бичачого альбуміну, міченого

родаміном сульфафторидом, в робочих розведеннях, зазначених на етикетках. Родамін сульфафторид використовують для забарвлення нормальних клітин з метою контрастування специфічного світіння ФІТЦ, зв'язаного з антигеном вірусу. Препарати знову інкубують у вологій камері (+37 град. C, 30 хвилин), відмивають фізіологічним розчином і досліджують під люмінесцентним мікроскопом. В цитоплазмі клітин, що мають антиген вірусу КВЕ, виявляється характерне яскраво-зелене світіння.

Виділення вірусу від хворого є прямим доказом захворювання на КВЕ. Цей метод залишається єдиним методом діагностики при дослідженні матеріалу від померлих в ранньому періоді хвороби, коли немає можливості виявити динаміку специфічних антитіл.

Негативний результат вірусологічного обстеження не виключає діагнозу КВЕ, оскільки в значній мірі залежить від того, в якій стадії захворювання одержаний матеріал для виділення вірусу, а також від правильної обробки матеріалу після збору і дотримання умов доставки його в лабораторію. Тривалість періоду вірусемії не перевищує 7 днів від початку захворювання. При обстеженні в перші 4 дні частота виділення вірусу з крові і спинномозкової рідини може дорівнювати 12-40%. Необхідний для дослідження час:

а) класичним методом біопроби (внутрішньомозкове інфікування новонароджених