Одержання, характеристика та використання ферментів отрути Щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys)

Проаналізувати вміст отрути щитомордника звичайного на присутність в ній ферментів, що діють на систему гемостазу.

Розробити методи виділення й очищення фібрин (оген) олітичного ферменту активатора протеїну С та інгібітора агрегації тромбоцитів.

Дослідити фізико-хімічні властивості отриманих ферментів та визначити їх дію на компоненти системи гемостазу.

Дослідити процес активації протеїну С активатором протеїну С та на його основі розробити умови діагностичного тесту для визначення рівня протеїну С в плазмі крові при порушенні функціонування системи гемостазу.

Наукова новизна одержаних результатів. Досліджено отруту щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys). Виявлено, виділено, очищено та охарактеризовано не описані раніше фібриногенолітичний фермент, активатор протеїну С та інгібітор агрегації тромбоцитів.

Розроблено умови виділення зазначених ферментів: замість трьохстадійного очищення на сефадексі G-100, G-75, іонообміннику типу DEAE-целюлоза, СМ-сефадекс А-50, TSK DEAE-650, Mono Q запропоновано метод іонообмінної хроматографії на Q-сефарозі в один етап при використанні ступінчатого градієнту NaCl.

Досліджено фізико-хімічні і біологічні властивості виділених ферментів, їх субстратну специфічність.

Проведено порівняння виділених ферментів з аналогічними компонентами, отриманими з отрути інших видів змій. Показано, що фібриногенолітичний фермент за своїми властивостями подібний до -фібриногеназ, які виявлені в отруті щитомордника інших видів; активатор протеїну С є аналогічним фірмовому препарату “Рrotac” (“Pentapharm”, AG, Швейцарія), виділеному з отрути Agkistrodon contortrix contortrix; з'ясовано, що інгібітор агрегації тромбоцитів відноситься до класу дезінтегринів і уповільнює агрегацію тромбоцитів, блокуючи тромбоцитарні рецептори фібриногену, зокрема, глікопротеїн IIb/IIIa

Практичне значення одержаних результатів. На основі ферментних препаратів отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) розроблено ряд діагностичних тестів для характеристики стану системи гемостазу. Так, активатор протеїну С використовується в тесті для визначення рівня протеїну С у плазмі крові. Висока швидкість активації протеїну С, відсутність у плазмі крові інгібіторів, а також резистентність активатора протеїну С до високої іонної сили і присутності іонів кальцію дає можливість використовувати отриманий препарат для визначення рівня протеїну С in vivo; тромбіноподібний фермент Анцистрон-Н використовується для характеристики заключного етапу системи зсідання крові та визначення вмісту фібриногену в плазмі крові при гепаринотерапії; для виявлення аномальних форм протромбіну служить активатор протромбіну, який виділений з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatus). Застосування тестів, що розроблені на основі ферментних препаратів зі зміїної отрути, дозволило створити алгоритми діагностики стану системи гемостазу при серцево-судинних захворюваннях (інфаркт міокарда), хірургічних ускладненнях (абдомінальні кровотечі при виразці шлунку, при регматогенному відшаруванні сітківки ока), цукровому діабеті. Тести, що запропоновано, є інформативними, високочутливими, простими у використанні, не потребують додаткового обладнання.

Зростаючий інтерес дослідників до класу фібрин (оген) олітичних ферментів обумовлений можливістю використовувати їх як для дослідження структурних взаємодій з іншими білками і ферментами, так і в якості прокоагулянтів для розчинення фібринових згустків при венозних тромбозах, інфаркті міокарда, інсультах, легеневій емболії.

Характеристика інгібітору агрегації тромбоцитів припускає, що блокада IIb/IIIa може бути використана як ефективна терапія при тромботичних ускладненнях. Таким чином, дезінтегрини можуть служити структурними прототипами агентів для розвитку антитромботичної терапії. Засновані на структурі дезінтегринів антитромботичні агенти можуть бути використані для збільшення реперфузії у пацієнтів, що проходять курс антитромботичної терапії при гострому інфаркті міокарда.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота – завершене дослідження, виконане автором відповідно до програми експериментальних досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 1995-2002 рр. Експериментальна частина роботи виконана дисертантом особисто. Аналіз та обговорення проведено спільно з науковим керівником. У наукових працях, написаних у співавторстві, автор приймав безпосередню участь.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були повідомлені на семінарі лабораторії Oxford bioresearch (м. Оксфорд, Великобританія, 1995 р.), наукових семінарах Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (2001 р., 2002 р.), VIII Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002 р.).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 9 друкованих праць, з них 7 статей, 1 тези доповіді в періодичних наукових спеціальних виданнях України, що включені в перелік, затверджений ВАК України. Опубліковано 1 патент.

Структура й обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури (1 розділ, 2 підрозділа), експериментальної частини (2 розділа, 4 підрозділа), заключення, висновків, списку використаної літератури (160 найменувань). Роботу викладено на 100 сторінках друкованого тексту, проілюстровано 19 рисунками, 18 таблицями, 1 схемою.

 

 

Огляд літератури

В огляді літератури представлено, що серед компонентів отрути змій особливий інтерес для гематологів мають ферменти-активатори та інгібітори, які впливають на різні етапи зсідання крові та фібринолізу. Представлено класифікацію ферментів отрути змій, характеристику прокоагулянтних, антикоагулянтних та фібрин (оген) олітичних ферментів, а також інформацію про використання компонентів отрути змій в наукових дослідженнях та практичній медицині.

Матеріали і методи

Кристалічну отруту щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) надано серпентарієм Трипільського біохімічного заводу (Золотухін).

Фібриноген бика (98% -не згортання) одержували з плазми крові шляхом висолювання 16% розчином сульфату натрію з наступним відділенням кріофібриногена за методом Варецької (1960).

Тромбін бичачий, 10 NIH /мг білка, Каунас, Литва.

Плазмін одержували з Глу-плазміногена, виділеного за методом афінної хроматографії на лізин-сефарозі (Deutch, Mertz, 1970), з наступною активацією урокіназою у співвідношенні Пг: Ук = 1: 1250 у 0, 05 М трис-НСl буфері, рН 7. 4, що містить 25% гліцерину (за об’ємом). В таких