Одержання, характеристика та використання ферментів отрути Щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys)

Т. М. Платонова, Т. М. Чернишенко, О. В. Горницька, О. М. Савчук, Л. І. Соколовська, М. Ш. Гамісонія, Є. М. Макогоненко Лабораторна діагностика порушень системи гемостазу при дисемінованому внутрішньосудинному зсідання крові // // Лаб. діагностика. – 2000. – №3. – С. 3-11.

Т. М. Платонова, О. В. Горницька, Є. Д. Мороз Застосування активатора протеїна С з отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) для визначення активності протеїну С у плазмі крові за різних патологій // Лаб. діагностика. – 2001. – №3. – С. 28-31.

Т. М. Платонова, О. В. Горницька, І. П. Метеліцина, О. М. Савчук Компоненти системи зсідання крові та фібринолізу в субретинальній рідині у людей з регматогенним відшаруванням сітківки ока // Мед. хімія. – 2001. – т. 3, №4. – С. 5-8.

О. В. Горницкая, И. Н. Ровинская, Т. Н. Платонова Выделение и свойства фибринолитического фермента, выделенного из яда щитомордника обыкновенного (Agkistrodon halys halys) // Укр. биохим. журн. – 2002. – Т. 74, № 3. – С. 42-49.

Платонова Т. М., Савчук О. М., Горницька О. В., Чернишенко Т. М., Гарбарчук О. І., Волков Г. Л. Особливості порушень стану системи гемостазу при цукровому діабеті // Мед. хімія. – 2002. – Т. 4, №2. – С. 5-9.

О. В. Горницька Використання ферментів з отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys) для діагностики порушень стану системи гемостазу (тези доповіді) // Укр. біохім. журн. – 2002. – Т. 74, № 4б (додаток 2). – С. 177.

Спосіб прогнозування тромботичних ускладнень при регматогенному відшаруванні сітківки ока / Горницька О. В., Платонова ТМ., Метеліцина І. П. / Пат. 43248 А Україна А 61 У5/145, 2001р. Опубл. бюл. №10, 2001р.

 

Горницька О. В. Одержання, характеристика і використання ферментів отрути щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys). – Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03. 00. 20 – Біотехнологія. – Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України. Київ, 2002.

Дисертація присвячена одержанню, очищенню, характеристиці і застосуванню ферментів, що містяться в отруті щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys).

Виявлено, що отрута щитомордника звичайного у своєму складі містить ферменти, які діють на систему зсідання крові і фібриноліза: тромбіноподібний фермент Анцистрон-Н, активатор протеїну С, фібриногенолітичний фермент, інгібітор агрегації тромбоцитів. Запропоновано прості та високоефективні методи виділення й очищення зазначених ферментів. Досліджено можливі області застосування отриманих препаратів.

Показано, що фібриногенолітичний фермент відноситься до класу -фібриногеназ: під дією ферменту в початковий період реакції руйнується A-ланцюг фібриногену. За фізико-хімічними властивостями отриманий фермент подібний до фібриногенолітичних ферментів, виділених з отрути інших видів змій роду Agkistrodon. Передбачається, що даний фермент може бути використаний при вивченні структурних і функціональних взаємодій систем зсідання крові і фібриноліза, а також може мати практичний інтерес для використання в медицині як дефібринуючий агент.

Виділено, очищено та охарактеризовано активатор протеїну С. Показано, що для активації протеїну С активатором з отрути щитомордника не потрібні тромбін, тромбомодулін і кальцій, що збігається з властивостями активаторів протеїну С, виділених з отрути змій інших видів. Відзначено високу швидкість активації протеїну С отриманим ферментним препаратом, що дозволяє використовувати його в клінічній практиці для визначення рівня протеїну С. На основі препарату активатора протеїну С розроблено діагностичний тест для визначення рівня протеїну С у плазмі крові в нормі та у випадку порушення функціонування системи гемостазу.

Перевірено дію інгібітору агрегації тромбоцитів на АДФ-стимульовану агрегацію тромбоцитів. Показано значне уповільнення швидкості агрегації при введенні отриманого препарату в збагачену тромбоцитами плазму крові.

На основі ферментів отрути щитомордника створено комплекс діагностичних тестів для визначення стану системи гемостазу при патологіях. Тести є інформативними, високочутливими, простими у використанні. Розроблено алгоритм діагностики стану системи гемостазу при цукровому діабеті і тест, що дозволяє прогнозувати тромботичні ускладнення при регматогенному відшаруванні сітківки ока в постопераційний період.

Ключові слова: отрута щитомордника звичайного, фібриногенолітичний фермент, активатор протеїну С, інгібітор агрегації тромбоцитів, ВЗК-синдром, гемостаз, діагностичні тести.

 

 

Горницкая О. В. Получение, характеристика и использование ферментов яда щитомордника обыкновенного (Agkistrodon halys halys). – Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03. 00. 20 – Биотехнология. – Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины. Киев, 2002.

Диссертация посвящена выделению, очистке, характеристике и применению ферментов, содержащихся в яде щитомордника обыкновенного (Agkistrodon halys halys).

Исследован яд щитомордника обыкновенного, обитающего на территории Дальнего Востока и Средней Азии. Обнаружено, что яд этой змеи в своем составе содержит ферменты, оказывающие действие на систему свертывания крови и фибринолиза: тромбиноподобный фермент Анцистрон-Н, активатор протеина С, фибриногенолитический фермент, ингибитор агрегации тромбоцитов.

Для получения и очистки вышеперечисленных ферментов разработаны простые и высокоэффективные методы выделения. Тромбиноподобный фермент выделен методом аффинной хроматографии цельного яда на цибакрон-сефарозе. Активатор протеина С, фибриногенолитический фермент, ингибитор агрегации тромбоцитов выделены методом ионообменной хроматографии на Q-сефарозе. Данный сорбент – сильный анионообменник, удобен вследствие большой емкости, высокой скорости элюции, широкого диапазона рН, обеспечивает максимальный выход белка (высокий процент связывания). После дальнейшей очистки указанные ферменты были получены в гомогенном виде, изучены их физико-химические и биологические свойства.

Исследования показали, что фибриногенолитический фермент относится к классу -фибриногеназ: под действием фермента в начальный период реакции разрушается A-цепь фибриногена. При более продолжительной инкубации фермент незначительно разрушает В-цепь, но -цепь остается интактной. Показано, что в начальный период реакции образуются '-''-фрагменты А-цепи с Мr 45 и Мr 30 кДа. Продукты деградации А-цепи происходят из наиболее доступной для гидролиза протеиназами С-концевой части молекулы фибриногена. По выявленным свойствам полученный фермент сходен с фибриногенолитическими ферментами, выделенными из яда других видов змей рода Agkistrodon. Основываясь на проведенных исследованиях, предполагается, что полученный нами фибриногенолитический фермент может быть использован при изучении структурных и функциональных взаимодействий систем свертывания крови и фибринолиза, а также может представлять практический интерес для использования в медицине.

Выделен, очищен и охарактеризован активатор протеина С, содержащийся в яде щитомордника обыкновенного. Показано, что для активации протеина С активатором не требуются тромбин, тромбомодулин и кальций, что совпадает со свойствами активаторов протеина С, выделенных из яда змей других видов. Отмечена высокая скорость активации протеина С полученным ферментом, что позволяет использовать его в клинической практике для определения уровня протеина С.

Показано, что активатор протеина С, выделенный из яда Agkistrodon halys halys, также, как и фирменный препарат активатора протеина С – “Рrotac” (“Pentapharm”, AG, Швейцария), выделенный из яда Agkistrodon contortrix contortrix, эффективно активирует протеин С в тесте АЧТВ. Для точного определения уровня протеина С используют и хромогенный субстрат протеина С – Хромозим 236. Основные преимущества данного метода заключается в легком и быстром тестировании больших количеств образцов с использованием микропланшетов. На основе препарата активатора протеина С разработан диагностический тест для определения уровня протеина С в плазме крови в норме и в случае нарушения функционирования системы гемостаза

Из яда щитомордника обыкновенного выделен и частично охарактеризован ингибитор агрегации тромбоцитов. Проверено действие ингибитора агрегации тромбоцитов на АДФ-стимулируемую агрегацию тромбоцитов. Показано значительное замедление скорости агрегации при введении полученного препарата в обогащенную тромбоцитами плазму крови.

На основе ферментов яда щитомордника создан комплекс диагностических тестов для определения состояния системы гемостаза при патологиях. Разработан алгоритм диагностики состояния системы гемостаза при сахарном диабете и тест, позволяющий прогнозировать тромботические осложнения при регматогенном отслоении сетчатки глаза в постоперационный период. Тесты, созданные на основе ферментных препаратов яда змей, являются информативными, высокочувствительными, простыми в использовании.

Ключевые слова: яд щитомордника обыкновенного, фибриногенолитический фермент, активатор протеина С, ингибитор агрегации тромбоцитов, ДВС-синдром, гемостаз, диагностические тесты.

 

 

Gornitskaya O. V. Isolation, characteristic and utilization of the enzymes from Agkistrodon halys halys venom. – Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03. 00. 20 – Biotechnology. – A. V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine. Kyiv, 2002.

The thesis is devoted to isolation, characteristic and utilization of the enzymes from Agkistrodon halys halys venom.

It is found that its venom contains the enzymes which act on the blood coagulation system and fibrinolysis, such as the thrombin-like enzyme Ancistron-H, protein C activator, fibrinogenolytic enzyme and inhibitor of the platelet aggregation. The simple and effective methods of isolation and purification of these enzymes have been developed. The possible fields of utilization of these enzymes have been investigated.

It is shown that fibrinogenolytic enzyme is -fibrinogenase. It digests A-chain of fibrinogen. According to its properties this enzyme corresponds to fibrinogenases from other species of Agkistorodon. It is possible that this enzyme may be used for study of structural and functional interactions of blood coagulation and fibrinolysis systems and for medical needs, as well.

Protein C activator has been characterized. It is shown that thrombin, thrombomodulin and calcium are not necessary for protein C activation by activator. It is correlated with properties of protein C activators from snake venom of other species. The rate of protein C activation is high under protein C activator action. It allows utilization of this enzyme for protein C level determination in blood plasma.

The diagnostic test for protein C level determination in blood plasma is developed on the base of protein C activator preparate.

The action of platelet aggregation inhibitor on ADP-dependent platelet aggregation is examined. It is shown that the rate of platelet aggregation became slow after addition of inhibitor to platelet-rich blood plasma.

Complex of diagnostic tests for determination of haemostasis system parameters under different pathologies is developed on base of snake venom enzymes. Tests are informative, high-sensitive and simple for use. Algorithm of the diagnostic of the haemostasis system state with diabetes is created. The test for prognosis of thrombotic complications at eye’s regmatogenic retinal detachment in postoperative period is elaborated.

Key words: Agkistrodon venom, fibrinogenolytic enzyme, protein C activator, platelet aggregation inhibitor, DIC, haemostasis system, diagnostic tests.