Одержання, характеристика та використання ферментів отрути Щитомордника звичайного (Agkistrodon halys halys)

Пул плазми крові одержували з крові 10 донорів. Кров брали пункцією ліктьової вени, натще, і негайно змішували з 3, 8% розчином цитрату натрію в пропорції 9: 1. Для одержання плазми кров центрифугували при 1, 5 тис. g.

Естеразну активність визначали спектрофотометрично, вимірюючи збільшення поглинання при довжині хвилі 253 нм, використовуючи ефіри амінокислот ВАЕЕ (N-бензоїл-L-аргініл-етиловий ефір), ВАМЕ (N-бензоїл-L-аргініл-метиловий ефір), BAPNA (N-бензоїл-L-аргініл-пара-нітроанілід), ТАМЕ (N-тозил-L-аргініл-метиловий ефір) в кінцевій концентрації 10 мМ (Hummel, 1959).

Амідолітичну активність визначали, використовуючи хромогенні субстрати плазміну – S2251, тромбіну – S2238, фактора Ха – S2765. Швидкість вивільненого під дією ферменту пара-нітроаніліна (p-NA) визначали в двопроменевому режимі при 405 – 492 нм на ридері Titertec Multiscan MC (“Titertech”, Фінляндія), приймаючи коефіцієнт поглинання 1М розчину пара-нітроаніліна при 405 нм рівним 10500 (Hutton, 1987).

Фібриногенолітичну активність виділених з отрути щитомордника ферментів визначали шляхом інкубації їх з фібриногеном (2мг/мл) протягом 20 хвилин при кімнатній температурі в 0, 05 М трис-НС1 буфері рН 7. 4, що містить 0, 13 М NaCl. Співвідношення фібриноген: фермент дорівнює 250: 1. Через 20 хв інкубації додавали 1 NIH/мл тромбіну, що є значним надлишком відносно кількості фібриногену в пробі. Утворений протягом декількох секунд фібриновий згусток видаляли центрифугуванням. Абсорбцію надосадової рідини вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 280 нм. За одиницю активності приймали кількість частково розщепленого фібриногену в хвилину на 1 мг ферменту, з огляду на те, що Е280 1% розчину фібриногену складає 15, 067.

Фібринолітичну активність визначали методом фібринових пластин (Astrup P., Mullertz S., 1952), наносячи зразок, що тестується, на поверхню пластини з наступним визначенням величини ділянки лізису фібрину. Ковалентне прошивання фібринових пластин здійснювалося активованим фактором ХІІІ системи зсідання крові, що присутній у препаратах фібриногену як домішок.

Дію ферментів на біологічні субстрати (протромбін, гемоглобін, протеїн С, плазміноген, фібриноген, фактор Х) перевіряли шляхом інкубації ферментів з очищеними білками, відбираючи через визначені проміжки часу аліквоти для електрофоретичного аналізу. Реакцію зупиняли додаванням ДS-Nа до 2% і -меркаптоетанола до 5% з наступним нагріванням зразків при 60оС протягом 10 хв.

Тромбіновий час зсідання плазми крові (ТЧ) визначали відповідно до розробленої методики. До 0, 2 мл прогрітої до 37оС плазми крові додавали 0, 1 мл тромбіну (0, 7 NIH/мл) і визначали час утворення згустку.

Визначення активності протеїну С в плазмі крові в тесті „активований частковий тромбопластиновий час” (АЧТЧ) проводили відповідно до розробленої нами методики. Суміш, що включає 0, 1 мл плазми крові, 10мкл (0, 2 мг/мл) РСА, 0, 1 мл АРТТ-реагента інкубували протягом 3 хв при 37оС, потім додавали 0, 1 мл 25 мМ СаСl2 і визначали час зсідання плазми крові. Як реагент АРТТ використовували кефалін з мозку кроля в 0, 1 мМ елаговій кислоті (bioMerieux, Франція).

Амінокислотний склад визначали на автоматичному амінокислотному аналізаторі Т-339 (“Microtekno”, Чехія) у літій-цитратному буфері в одноколоночному циклі. Гідроліз білків проводили в 6 М HCl у запаяних ампулах при температурі 120оС протягом 4 год, після чого гідролізат багаторазово випаровували на водяній бані для видалення кислоти.

Хроматографічні дослідження проводили із застосуванням системи для рідинної хроматографії високого тиску – FPLC (Pharmacia, Швеція). У роботі використовували Q-сефарозу для іонно-обмінної хроматографії, суперозу 12В, сефакріл S-300 для гель-фільтрації, цибакрон-сефарозу для афінної хроматографії та алкіл-сефароза для гідрофобної хроматографії.

Електрофорез у поліакриламідному гелі (ПААГ) в присутності DS-Na проводили за методом Леммлі (1970) на приладі для вертикального гель-електрофорезу (Bio-Rad, США) у пластинах товщиною 0, 75 або 1 мм. Як маркери використовували суміш білків Low Molecular Weigt Calibration Kit фірми Pharmacia (Швеція) з відомою молекулярною масою, кДа: фосфорилаза Б – 94; альбумін – 67; овальбумін – 43; карбоангідраза – 30; соєвий інгібітор трипсину – 20, 1; лактальбумін – 14, 4 (“Pharmacia”, Швеція).

 

 

Виділення і вивчення властивостей ферментів отрути щитомордника звичайного

Процес виділення ферментів зі зміїної отрути досить громіздкий: включає трьохстадійне хроматографічне очищення білків на сефадексі G-100, G-75, іонообміннику типу DEAE-целюлоза, СМ-сефадекс А-50, TSK DEAE-650, Mono Q. Подібне одержання препаратів вимагає великої витрати часу, матеріалів. Крім того, на кожному етапі очищення відбувається часткова втрата активного матеріалу. Тому перед нами стояла задача розробити простий і ефективний метод виділення матеріалу.

Для дослідження було взято отруту щитомордника звичайного (Agkisrodon halys halys).

При розробці умов одержання фібриногенази основним завданням було скорочення кількості етапів очищення шляхом видалення з цільної отрути матеріалу, що коагулює. Для цього ми використовували цибакрон-сефарозу (блакитна агароза) – хроматографічний носій, що містить іммобілізований барвник цибакрон голубий F3GA. Цей сорбент, що має широку специфічність до різних груп білків, застосовується при очищенні різних ферментів. Крім того, барвник цибакрон F3GA дешевий, синтез сорбентів на його основі дуже простий, а ємність такого сорбенту на порядок вища, ніж у будь-яких інших афінних сорбентів.

Для цього 100 мг кристалічної отрути Agkistrodon halys halys розчиняли в 2 мл 0, 02 М